一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法，属于生命科学蛋白质组技术领域，特别涉及小麦低分子量谷蛋白亚基分子量的精确鉴定以及基于此技术方法对麦谷蛋白亚基的进一步表征。本发明专利技术一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法，包括如下步骤：（１）制备小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱样品时，先用３５－４５％的丙酮沉淀蛋白提取液，离心后取上清，再用７５－８５％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亚基；（２）在获得低分子量谷蛋白亚基沉淀后，用溶解液溶解小麦低分子量谷蛋白亚基，以溶解液体积为计量基准，溶解液中乙腈溶液的体积为溶解液体积的１５－２５％，ＴＦＡ所占的体积为溶解液体积的０．１％，其余为水。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生命科学蛋白质组
，特别涉及小麦低分子量谷蛋白亚基分子量的精确鉴定以及基于此技术方法对麦谷蛋白亚基的进一步表征。
技术介绍
小麦是世界上栽培面积最大、产量最高、地理分布最广的重要农作物，其种植面积和产量约占谷物作物的30％，被广泛应用于食品加工业与家畜饲养业。小麦种子中含有其他粮食作物中所欠缺的面筋蛋白，可制作面包、面条、饼干、糕点和馒头等多种专用食品。因此，种子蛋白的组成和含量在很大程度上决定小麦加工品质的优劣。Osborne(1907)根据溶解特点的不同将小麦种子蛋白分为以下四类清蛋白和球蛋白、麦醇溶蛋白、麦谷蛋白。研究表明，小麦谷蛋白多聚体是自然界最大的蛋白分子(Wrigley，1996；Stevenson和Preston，1996)。通常所说的小麦贮藏蛋白是指醇溶蛋白和麦谷蛋白，其中麦谷蛋白约占贮藏蛋白的40％左右。根据还原条件下在SDS-PAGE中的迁移率不同，又可将麦谷蛋白分为两类高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)。HMW-GS的组成和含量直接影响小麦面粉的烘烤质量，而LMW-GS则与面团弹性密切相关。大量研究表明，LMW-GS位点的等位变异与小麦的品质差异具有高度相关性。1984年Payne等首先发现LMW-GS组成与四倍体小麦品质有直接关系，例如具有LMW-1型电泳图谱的品种往往拥有较差的加工品质，而具有LMW-2型电泳图谱的品种则恰恰相反，往往具有优良的品质特性。1997年Nieto-Taladriz等发现构成LMW-1、LMW-2型的亚基由Glu-3、Glu-2位点上的等位基因控制。Luo等(2001)在比较普通小麦HMW-GS和LMW-GS等位变异对面粉品质影响时发现，Glu-3位点的等位变异对小麦品质相关的技术参数具有显著的影响，如面粉蛋白含量、SDS沉淀值、子粒硬度等。迄今为止，研究单个LMW-GS对小麦品质的影响还比较少。1998年Sissons等用RP-HPLC分离了一些LMW-GS进行品质研究，发现N-端为METSHIPGL-的LMW-GS可以改善面粉的混合特性。1999年Lee等对细菌表达的3个LMW-GS进行了品质的研究，发现来自一粒小麦A基因组的LMW-E2和LMW-E4比来自一粒小麦D基因组的LMW-16/10能够更有效地提高面粉合面特性，增加面团的延展性。基于在SDS-PAGE中迁移率的不同，可将LMW-GS分为B、C和D型亚基。B型亚基的相对分子质量为40000-50000Da，C型亚基的相对分子质量为30000-40000Da，D型亚基是很微小的一部分，仅在少数小麦品种中出现。编码B型亚基的基因位点在第一部分同源群染色体短臂的Glu-3位点。编码C型亚基的基因位点可能在第一部分同源群染色体短臂的Gli-1位点或在第6部分同源群染色体短臂上的Gli-2位点。D型亚基也许在Gli-1位点。研究表明低分子量谷蛋白亚基基因位点与醇溶蛋白的基因位点紧密相连，如Gli-1位点，含有3种蛋白质基因ω醇溶蛋白基因、γ醇溶蛋白基因和低分子量谷蛋白亚基基因。B型亚基和C型亚基有相似的结构。中央重复区都全部由脯氨酸和谷氨酞胺的重复序列组成，这些重复序列主要形成β转角。N端是一个非常短的非重复序列，C端也由非重复序列组成，其二级结构主要为α螺旋，且包含其所有的半胱氨酸残基。C端的8个半胱氨酸残基的位置是高度保守的。B型亚基中有1～8号中的6个半胱氨酸残基(1-5和7号)，另外还有一个6’在C端。对B型低分子量谷蛋白亚基的测序发现一些B型低分子量谷蛋白亚基还含有另外一个半胱氨酸残基。对编码B型低分子量谷蛋白亚基的基因序列分析表明，其N端应有一个半胱氨酸残基，但是在大多数小麦品种的B型低分子量谷蛋白亚基中却没有发现，而在中央重复区的N端发现有一个半胱氨酸残基。C型低分子量谷蛋白亚基和α或γ醇溶蛋白结构相似。可能是由于醇溶蛋白基因发生了突变，使其可以形成分子间二硫键，所以属于谷蛋白类。醇溶蛋白是单体蛋白，不能形成聚集体。Cα型和Cγ型分别含有6个和8个保守的半胱氨酸残基，然而Cα型亚基的基因序列显示在N端应有一个半胱氨酸残基。在Cγ型中央重复区的N端有一个半胱氨酸残基。另外，在Cγ型亚基中央重复区，一些小麦品种中另外出现了一个半胱氨酸残基。D型低分子量麦谷蛋白亚基和C型亚基一样与醇溶蛋白有相似的生化特性，甚至氨基酸序列也是如此。D型亚基和ω型醇溶蛋白一样属于贫硫蛋白，由很小的N端、C端和中央重复区组成。中央重复区富含谷氨酰胺，脯氨酸和苯丙氨酸，由交搭β转角组成。一般认为D型低分子量谷蛋白亚基可能是由ω型醇溶蛋白编码基因突变而造成一个半胱氨酸残基能够形成分子间二硫键，形成聚合体而导致的。与HMW-GS相比，低分子量麦谷蛋白亚基的组成更为复杂，一个品种一般具有20-50个基因。因此，长期以来由于缺乏有效的分离方法，与HMW-GS相比，国内外对LMW-GS的研究相对滞后，由于常规分离方法SDS-PAGE分辨度不高，操作复杂，所得到的分子量往往与实际的分子量相差较大，因此急需建立新的、更加有效的分离鉴定技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于确立一种稳定、快速的质谱方法，从而可以对小麦低分子量谷蛋白亚基进行精确的分子量测定。通过这一蛋白质组学技术，可快速准确的鉴定出小麦低分子量谷蛋白亚基的分子量，分析小麦谷蛋白的低分子量亚基组成，从而鉴定并表征不同品种的小麦。本专利技术采用的技术方案是，包括如下步骤1.在制备小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱样品时，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，离心后取上清，再用75-85％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亚基；2.在获得低分子量谷蛋白亚基沉淀后，用溶解液溶解小麦低分子量谷蛋白亚基，溶解液的配比为以溶解液体积为计量基准，溶解液中乙腈溶液的体积为溶解液体积的15-25％，TFA所占的体积为溶解液体积的0.1％，其余为水。在制备小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱样品时，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，目的在于先去除蛋白提取液中的高分子量谷蛋白亚基。目前小麦低分子量谷蛋白亚基分子量的测定主要采用SDS-PAGE凝胶电泳方法。但SDS-PAGE测定蛋白质的分子量是根据蛋白质的迁移率和分子量的对数间的线性关系对其进行分子量的测定，但有一部分蛋白质在SDS体系中的相对迁移率与其分子量不呈线性关系，如电荷异常或构象异常的蛋白质，组蛋白F1本身带有大量的正电荷，结合的SDS不足以消除原来正电荷的影响，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白(例如胶原蛋白)和一些含二硫键较多的蛋白质，电泳的相对迁移率与分子量的对数不呈线性关系。所以传统的SDS-PAGE对蛋白分子量的测定存在很大误差。质谱是通过测定样品离子的质荷比来进行分子量测定的方法，其精确度极高。本专利技术以质谱技术为核心，建立了一套精确测定小麦低分子量谷蛋白亚基分子量的方法。质谱是通过测定样品离子的质荷比来进行成份和结构分析的方法，其发展得益于两种软电离技术的发展(张国安等，2003)电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。电喷雾电离方法是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电在N气流的作用下，液滴爆裂并最终成喷雾状，分析物离子化以带电荷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法，包括如下步骤：（１）在制备小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱样品时，先用３５－４５％的丙酮沉淀蛋白提取液，离心后取上清，再用７５－８５％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亚基；（２）在获得低分子量谷蛋白亚基沉淀后，用溶解液溶解小麦低分子量谷蛋白亚基，溶解液的配比为：以溶解液体积为计量基准，溶解液中乙腈溶液的体积为溶解液体积的１５－２５％，ＴＦＡ所占的体积为溶解液体积的０．１％，其余为水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：晏月明，张倩，李巧云，安学丽，张艳贞，王爱丽，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]