一种检测19-去甲睾酮的方法及其专用酶联免疫试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测１９－去甲睾酮的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该检测１９－去甲睾酮的酶联免疫试剂盒，包括１９－去甲睾酮特异性抗体及包被原和酶标记物；所述包被原为１９－去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物或抗抗体；所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标１９－去甲睾酮半抗原；当所述包被原为１９－去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标１９－去甲睾酮半抗原。本发明专利技术的方法操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查的检测动物组织、尿样中１９－去甲睾酮药物残留量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测19-去甲睾酮的方法及其专用酶联免疫试剂盒。
技术介绍
19-去甲睾酮(19-nortestosterone，NT)是一种合成激素，是具有雄激素作用，属于合成代谢类类固醇。临床主要用于治疗贫血老年性骨质疏松，还能促进肌肉的生长发育，增加训练耐力和训练负荷。但其也存在着很严重的副作用，母体摄入会使女性胎儿男性化，引起生殖性畸形。女性长期服用会产生男性化特征，男性长期服用会导致过早秃顶。短期大剂量服用会导致肝功能障碍，还可能导致癌症、糖尿病、精神错乱等。因此，加强对该药物的检测是十分必要的。检测19-去甲睾酮残留量的化学方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气—质联机(GC/MS)、液—质联机(HPLC/MS)、毛细管电泳(CE)等，由于所需仪器设备复杂和过程繁琐，不适合现场监控和大量样本筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测19-去甲睾酮的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的检测19-去甲睾酮的酶联免疫试剂盒，包括19-去甲睾酮特异性抗体及包被原和酶标记物；所述包被原为19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物或抗抗体；所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标19-去甲睾酮半抗原；当所述包被原为19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标19-去甲睾酮半抗原。所述19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将19-去甲睾酮半抗原和载体蛋白用混合酸酐法或活性酯法或水溶性碳化二亚胺法(EDC)进行偶联得到；所述19-去甲睾酮半抗原是将19-去甲睾酮和琥珀酸酐通过酰化反应得到的；所述载体蛋白可为卵清蛋白(OVA)、兔血清白蛋白(RSA)或鼠血清白蛋白(MSA)等。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选碱性磷酸酯酶；碱性磷酸酯酶标记抗抗体可采用现有技术中的多种方法如戊二醛法或过碘酸钠法将酶交联在抗抗体上；碱性磷酸酯酶标记的19-去甲睾酮半抗原可采用混合酸酐法将碱性磷酸酯酶与19-去甲睾酮半抗原偶联得到。所述19-去甲睾酮半抗原是将19-去甲睾酮和琥珀酸酐通过酰化反应得到的。所述19-去甲睾酮特异性抗体可为19-去甲睾酮单克隆抗体或19-去甲睾酮多克隆抗体；它们均是用19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述19-去甲睾酮单克隆抗体为19-去甲睾酮鼠单克隆抗体，所述19-去甲睾酮多克隆抗体优选为19-去甲睾酮兔多克隆抗体。所述抗抗体为羊抗鼠或羊抗兔抗抗体，优选为羊抗兔抗抗体。所述19-去甲睾酮鼠单克隆抗体优选为19-去甲睾酮的单克隆杂交瘤细胞株A-3-3 CGMCC No.1613分泌的抗体。19-去甲睾酮的单克隆杂交瘤细胞株A-3-3 CGMCC No.1613已于2006年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。以上抗体均可以用19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原按常规方法制备。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血兰蛋白等常用载体蛋白；所述19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将19-去甲睾酮半抗原和载体蛋白用活性酯法或混合酸酐法进行偶联得到；所述19-去甲睾酮半抗原是将19-去甲睾酮和琥珀酸酐通过酰化反应得到的。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括19-去甲睾酮标准品溶液、显色剂、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。所述浓缩洗涤液为0.01M～0.05M、含0.01％叠氮化钠(Na3N)和1％吐温80的磷酸盐缓冲液；所述百分含量为质量百分含量。本专利技术试剂盒的浓缩洗涤液中含有的叠氮钠在溶液中抑制细菌的生长，对溶液的稳定性其到一个保护作用。当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，所述显色剂为4-硝基酚磷酸盐缓冲液。所述浓缩复溶液可为含0.5％牛血清白蛋白和0.1％吐温20、0.01～0.05M的磷酸盐缓冲液；所述百分含量为质量百分含量。所述包被缓冲液为pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液是含有5％脱脂奶粉的0.01～0.05M磷酸盐缓冲液；所述百分含量为质量百分含量；所述终止液为1～2mol/L的硫酸、盐酸或氢氧化钠缓冲液。本专利技术所提供的检测19-去甲睾酮的方法，包括以下步骤1)样品前处理当样品为动物组织或饲料时，用均质器均质动物组织样品或饲料，称取2g样品和0.5g抗坏血酸加入到8ml乙腈和2ml 1mol/L氢氧化钠的混合液中，振荡混匀，室温3000g以上，15℃，离心10-15分钟，取上清液1ml移置离心管中，加入1ml 1mol/L氢氧化钠和2ml乙腈，混匀，再加入3ml正己烷和二氯甲烷的混合液(正己烷与二氯甲烷的体积比为8∶2)振荡混匀，3000g以上，15℃，离心10-15分钟，去除上层正己烷相，取中间层有机相在氮气流下完全干燥，用1ml的上述的用去离子水稀释2倍的浓缩复溶液溶解干燥的残留物取水相，即可进行分析；当样品为尿液时，取2ml尿液到离心管中，3000g以上，15℃，离心10-15分钟直至清亮，移取1ml尿液到离心管中，加入2ml的乙腈，再加入3ml正己烷和二氯甲烷的混合液(正己烷与二氯甲烷的体积比为8∶2)混匀，3000g以上，15℃，离心10-15分钟，去除上层正己烷相，取中间层有机相在氮气流下完全干燥，用1ml上述的用去离子水稀释2倍的浓缩复溶液溶解干燥的残留物，取水相进行分析。2)利用上述检测19-去甲睾酮的酶联免疫试剂盒检测样品。其中可作为固定19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物或19-去甲睾酮抗抗体的载体物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。其中优选为聚苯乙烯制成的微量反应板凹孔，其优点为聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗原吸附其上后还是保留原来的免疫活性，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。本专利技术的检测19-去甲睾酮的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测动物组织、饲料及尿液等样品中19-去甲睾酮的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。将19-去甲睾酮和琥珀酸酐通过酰化反应合成半抗原，其优点在于给19-去甲睾酮接出一个含4个碳链的间隔臂，突出了19-去甲睾酮分子结构中的特征基团——睾酮，使制备的19-去甲睾酮抗体对19-去甲睾酮免疫原或包被原均有很高的识别能力。再将19-去甲睾酮半抗原采用混合酸酐法与载体蛋白偶联得到免疫原。半抗原与载体蛋白的结合比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与KLH、RSA和HSA的结合摩尔比分别为12∶1、17∶1和17∶1。本专利技术的试剂盒可定性、定量检测动物组织、尿样等样品中19-去甲睾酮的残留量。本专利技术的检测原理是当微孔条上预包被19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物时，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测１９－去甲睾酮的酶联免疫试剂盒，包括１９－去甲睾酮特异性抗体及包被原和酶标记物；所述包被原为１９－去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物或抗抗体；所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标１９－去甲睾酮半抗原；当所述包被原为１９－去甲睾酮半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标１９－去甲睾酮半抗原；所述１９－去甲睾酮半抗原是将１９－去甲睾酮和琥珀酸酐通过酰化反应得到的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建忠，何方洋，万宇平，张素霞，冯才伟，史为民，吴小平，汪善良，江海洋，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]