本发明专利技术涉及生物医药工程技术领域，全球ＨＣＶ感染者约有１．７亿，７０％以上的ＨＣＶ感染会发展为慢性感染，ＨＣＶ包膜蛋白Ｅ２介导ＨＣＶ与靶细胞的结合，是涉及ＨＣＶ感染性的最关键蛋白，而Ｅ２蛋白属于低表达蛋白，用基因重组方法获得哺乳动物细胞表达的该蛋白相当困难。本发明专利技术的目的在于提供一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白Ｅ２的方法，该方法构建了一种新型的哺乳动物细胞表达质粒，该表达质粒高水平表达目标基因Ｅ２蛋白，而低水平表达筛选标记谷氨酰氨合成酶。本发明专利技术能批量制备具有ＨＣＶ包膜蛋白天然生物学功能以及抗原性的重组ＨＣＶ包膜Ｅ２蛋白，为ＨＣＶ感染的血清学检测试剂以及ＨＣＶ疫苗的开发奠定了基础，并可以为ＨＣＶ分子病毒学研究提供重要材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药工程
，尤其涉及一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2的方法。
技术介绍
丙型肝炎病毒(HCV)是经血液传播的急、慢性肝炎的主要致病因子之一，目前全球HCV感染者约有1.7亿，60％以上的HCV感染会发展为慢性感染。HCV慢性感染与肝硬化、肝细胞癌具有高度相关性，并且还与淋巴瘤、冷球蛋白血症等密切相关。虽然目前已经建立了且已商品化的HCV感染诊断方法，但应用最广泛的血清学诊断方法，即酶联免疫吸附试验(ELISA)方法还有一定的漏检率，需要增加一些有诊断意义的病毒抗原。此外，目前还没有研制成功一种疫苗能有效预防HCV感染。HCV包膜蛋白包括E1和E2两种，其中E2介导HCV与靶细胞的结合，是涉及HCV感染性的最关键蛋白。有报道，在ELISA诊断试剂中加入E2合成肽能提高检测的敏感性，减少漏检，因此，有必要将该蛋白参入目前的基于HCV核心蛋白和非结构蛋白的ELISA检测中。由于E2蛋白在HCV与靶细胞结合中的关键作用，因此，该蛋白可作为HCV疫苗的重要候选抗原。但是，只有哺乳动物细胞表达的具有高度糖基化以及天然空间构型的E2蛋白才具有与靶细胞结合的生物学功能以及天然的抗原性，而E2蛋白属于低表达蛋白，用基因重组的方法获得哺乳动物细胞表达的该蛋白具有相当技术难度。这也是目前在ELISA方法中未引入E2蛋白的主要原因，也是妨碍HCV疫苗研究的重要原因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法。本专利技术提供了一种能用哺乳动物细胞高水平分泌表达HCV包膜E2蛋白的技术方法，首先构建了一种新型的哺乳动物细胞表达质粒载体，该质粒载体利用强的真核启动子高水平调控HCV包膜E2基因的表达，而借助于内含子的剪切功能控制筛选用的标记基因(谷氨酰氨合成酶基因，GS)仅低水平表达。将该表达质粒转染哺乳动物细胞，以甲硫酰硫酸胺(MSX)筛选稳定转染的细胞克隆，因MSX为GS的高效抑制剂，故只有染色体中高拷贝整合质粒编码基因的细胞才能存活，而存活的细胞能高水平表达质粒编码的目的基因--HCV包膜E2基因。本专利技术中用目前最广泛用于哺乳动物细胞基因重组蛋白工程的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为宿主细胞，以该质粒转染CHO-K1细胞，构建成功稳定高水平分泌表达HCV包膜E2蛋白的细胞株，并建立了该细胞株的无血清悬浮培养方法，因培养液中不含有牛血清等蛋白成分，从而能以简单的层析方法从培养液中纯化得到重组HCV包膜E2蛋白。本专利技术的具体内容如下1.HCV包膜E2蛋白胞外段基因的扩增根据1b基因型HCV包膜E2蛋白编码基因的核苷酸序列设计、合成引物，以聚合酶链反应(PCR)扩增HCV包膜E2蛋白胞外段基因，插入T克隆载体，对E2胞外段基因进行DNA测序。2.谷氨酰胺合成酶基因的克隆根据谷氨酰胺合成酶(GS)基因的序列，设计合成引物，以逆转录(RT)PCR从中国仓鼠卵巢细胞(CHO)克隆GS基因，插入T克隆载体，对GS基因进行DNA测序。3.基于内含子剪切载体的构建将GS基因插入真核表达质粒载体pCI-neo(美国Promega产品)的内含子基因的剪切供体(SD)与剪切受体(SA)位点之间，而将HCV包膜E2蛋白基因置于GS基因内含子之3′端。4.表达质粒转染CHO细胞用脂质体将质粒转染CHO细胞，检测HCV包膜E2蛋白的表达。5.稳定表达HCV包膜E2蛋白的CHO细胞株的构建以低浓度的GS抑制剂--甲硫酰硫酸胺(MSX)筛选稳定转染的CHO-K1细胞克隆，再以浓度递增的MSX加压筛选高水平表达HCV包膜E2蛋白的CHO-K1细胞，然后逐渐以无血清培养液替代含小牛血清的培养液，使细胞完全适应于无血清培养生长。6.重组HCV包膜E2蛋白的抗原性鉴定用单抗和多抗鉴定从细胞培养上清中的HCV包膜E2蛋白的抗原性。本专利技术能批量制备具有HCV包膜蛋白天然生物学功能以及抗原性的重组HCV包膜E2蛋白，为HCV感染的血清学检测试剂以及HCV疫苗的开发奠定了基础，并可以为HCV分子病毒学研究提供重要材料。附图说明图1pCIDA-GS-E2-neo质粒的结构图2Western blot分析胞浆内和分泌至培养上清中的E2蛋白(用羊抗E2多抗检测)其中1，2pCIDA-GS-E2-neo转染的CHO-K1细胞裂解液3pCIDA-GS-E2-neo转染的CHO-K1细胞培养上清4pCIDA-GS-neo转染的CHO-K1细胞裂解液图3dot blot培养上清中的E2蛋白(用E2单抗检测)其中1，2pCIDA-GS-neo转染的CHO-K1细胞培养上清3，4pCIDA-GS-E2-neo转染的CHO-K1细胞培养上清图4分泌表达的HCV包膜E2蛋白的SDS-PAGE分析具体实施例方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步描述。实施例11.HCV包膜E2蛋白胞外段基因的扩增根据1b基因型HCV包膜E2蛋白编码基因的核苷酸序列设计、合成引物，以聚合酶链反应(PCR)扩增HCV包膜E2蛋白胞外段基因。为了使表达产物便于纯化，在E2胞外段基因的3′末端引入了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列。PCR扩增的模板质粒pGEM-HCJ4含有1b型HCV基因全序列，为美国国立卫生研究院Yanagi M博士构建、提供(参见Virology.1998；244(1)161-72)。DNA扩增用试剂为美国Promega产品。引物序列(下游引物E2R含SalI酶切位点)E2F5′-GAGACCCACACGACGGGGAG-3′E2R5′-GTCGACAACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCTGACCTATCCCTGTCC-3′在0.5毫升离心管建立以下反应体系质粒pGEM-HCJ4 10ng10×Pfu聚合酶反应缓冲液 5μl引物E2F(5mM)2μl引物E2R(5mM)2μldNTP(10mM) 1μlPfu聚合酶(3U/μl) 0.5μl补充双蒸灭菌水至总反应体积50μl，用MJ PTC-100型PCR仪进行热循环反应94℃变性2分钟，94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸1分钟20秒，共进行30个循环，然后72℃延伸5分钟，温度降至4℃结束反应。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收。2.E2基因与人免疫球蛋白信号肽基因的拼接为了使重组HCV包膜E2蛋白能分泌表达，在该基因的5′末端引入人免疫球蛋白信号肽基因。合成引物(上游引物ISF含NheI酶切位点)ISF5′-GCTAGCGCCACCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCC-3′ISR5′-CTCCCCGTCGTGTGGGTCTCGGCGTCGCCGGTGCTGCCGGGCACCCACAGCAGCAGC-3′在0.5毫升离心管建立以下反应体系10×Taqase反应缓冲液5μl引物ISF(5mM)2μl引物ISR(5mM)2μldNTP(10mM) 1μlTaqase聚合酶(5U/μl)0.2μl补充双蒸灭菌水至总反应体积50μl，用MJ PTC-100型PCR仪进行热循环反应94℃变性2分钟，94℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸30本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白Ｅ２的方法，其特征在于该方法构建了一种新型的哺乳动物细胞表达质粒，该表达质粒高水平表达作为目标基因的丙型肝炎病毒包膜蛋白Ｅ２，而低水平表达作为筛选标记的谷氨酰氨合成酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵平，廖小玲，曹洁，戚中田，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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