一种沙眼衣原体的遗传标记物和检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种用于检测沙眼衣原体的遗传标记物和利用该遗传标记物来检测沙眼衣原体的ＬＣＲ方法及其试剂盒，特别涉及ＬＣＲ产物的检测在ＬＣＲ的过程中实时进行。本发明专利技术可方便、快速、准确地定性检测沙眼衣原体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及连接酶链式反应。
技术介绍
衣原体(Chalmydiae)是一类在真核细胞内专营寄生生活的微生物。它在宿主细胞内的生长繁殖会引起宿主的临床表征。衣原体属分为沙眼衣原体(C.trachomatis以下为Ct)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和肺炎衣原体(C.pneumonia)三个种。其中沙眼衣原体、肺炎衣原体是能引起人类疾病的病原体，如沙眼、男性非淋菌性尿道炎、女性衣原体性宫颈炎、肺炎。临床检测沙眼衣原体已建立了多种方法。细胞培养法检测沙眼衣原体，采用单层真核细胞，经孵育后用荧光标记的抗体、酶结合的单克隆抗体，碘或姬姆萨染色，在显微镜下观察细胞内有无包涵体。直接荧光抗体测定(DFA)将针对Ct的单克隆抗体用荧光标记，与标本中的Ct结合后，荧光显微镜检查就能见到发荧光的原体(Ebs)。科研中常被用作确证试验。酶免疫测定(EIA)用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测Ct的LPS(脂多糖抗原)或外膜蛋白基因(major outer membrane protein gene，MOMP)(Poole E，Lamont I.Chlamydia trachomatis serovar differentiation by direct sequence analysisof the variable segment 4 region of the major outer membrane gene.InfectImmun，1992，601089-1094.)，酶反应生成有色产物，用酶标仪进行测定，适于短时内大批直接检测病原体核酸的方法有聚合酶链式反应(PCR)技术和连接酶链式反应(LCR)技术。PCR技术已也得到广泛应用，是当前病原体核酸检测和序列分析的主要方法。LCR的基本原理为利用DNA连接酶，特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增。其程序为在模板DNA、DNA连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下，首先加热至一定温度(比如94～95℃)使DNA变性，双链打开，然后降温退火(比如65℃)，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增。若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物。LCR的引物是两对分别互补的引物，LCR识别点突变的特异性高于PCR，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性。LCR连接反应温度接近寡核苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高。LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94℃变性和65℃复性并连接，循环30次左右。同PCR相比，由于使用两对引物，用LCR检测Ct感染，具有更高的敏感性和特异性，国内应用较少。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测沙眼衣原体的遗传标记物，和能够有效检测沙眼衣原体LCR产物的反应方法及试剂盒。技术方案本专利技术提供一种用于检测沙眼衣原体的遗传标记物，其核苷酸顺序如SEQ ID NO2所示的脱氧核糖核酸顺序或其互补顺序，或者其编码的核糖核酸顺序或其互补顺序。本专利技术同时提供以所述的用于检测沙眼衣原体的遗传标记物来检测沙眼衣原体的连接酶链式反应方法，其特征在于所述反应的步骤依次包括 (1)抽提样品的DNA；(2)将抽提的DNA作为模板，用至少两对正反引物进行LCR扩增；(3)检测扩增产物；其中，一对引物A和B中的B与SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，A与SEQ ID NO1中所示的部分序列互补；第二对引物A’和B’分别与A和B互补，引物的长度范围均为15-40个核苷酸，而且，在扩增结束后或者扩增的同时进行产物检测。本专利技术提供上述的检测沙眼衣原体的连接酶链式反应方法的一种优选方案为，所述引物长度范围均为20-26个核苷酸。本专利技术提供上述的检测沙眼衣原体的连接酶链式反应方法的另一种优选方案为，所述反应的扩增产物的长度为30-80个核苷酸对。本专利技术还提供上述的检测沙眼衣原体的连接酶链式反应方法的另一种优选方案为，其特征在于所述的引物可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。优选通过检测荧光信号的强弱来定性检测样品中的沙眼衣原体。上述技术方案及其优选方案中任一项所述的检测沙眼衣原体的连接酶链式反应方法的一种具体运用中，所述四条引物的一端标均记有荧光基团，其中A引物3’端第五碱基处标记FITC(异硫酸酯荧光素)，B引物5’端第五碱基处标记R640(ROCHE公司的RED640荧光染料)，A’引物5’端第五碱基处标记FITC，B’引物3’端第五碱基处标记R640；或者，所述四条引物中的A引物3’端第五碱基处标记R640，B引物5’端第五碱基处标记FITC，A’引物5’端第五碱基处标记R640，B’引物3’端第五碱基处标记FITC。本专利技术也提供应用所述的检测沙眼衣原体的遗传标记物及其检测方法的试剂盒，试剂组成包括荧光LCR反应液、阳性对照品、阴性对照品，其中阳性对照品是含有所述的SEQ ID NO2的核苷酸序列，优选含有所述的SEQ ID NO2的核苷酸序列的质粒。本专利技术从沙眼衣原体基因组中有目的地选出了不少于1120个核酸对的衣原体外膜蛋白基因MOMP，该基因在每个病原体中至少存在一个拷贝，适合作为特异性LCR检测的扩增靶序列。如本文所用，术语“major outer membrane protein gene”或“外膜蛋白基因”指编码沙眼衣原体外膜蛋白的核苷酸序列，其GenBank登录号X55700，具体序列示于SEQ ID NO1。本专利技术提供的检测沙眼衣原体的遗传标记物可以是SEQ ID NO1中的长度为10-1100个碱基的连续的脱氧核糖核酸顺序或其互补顺序，或者其编码的核糖核酸顺序或其互补顺序，优选如SEQ ID NO2所示的核苷酸顺序。本专利技术提供的利用所说的遗传标记物来检测沙眼衣原体的连接酶链式反应方法，反应步骤中检测扩增产物是用以确定样品中是否存在沙眼衣原体，即定性检测；优选通过检测荧光信号的强弱来检测样品中的沙眼衣原体。基于SEQ ID NO1和2，本专利技术不仅提供了一种利用连接酶链式反应扩增MOMP基因检测沙眼衣原体的方法，还提供一种快速检测沙眼衣原体的荧光LCR试剂盒，试剂组成除了包括荧光LCR反应液、阳性对照品、阴性对照品，之外还可以包括DNA裂解液。本专利技术的关键是使用了两对特异性扩增沙眼衣原体遗传标记物的引物对，引物长度均为15-40个核苷酸，且A引物的序列为SEQ ID NO3，与SEQID NO1所示的部分序列相同，且B引物的序列为SEQ ID NO4，与SEQ IDNO1所示的部分序列互补，第二对引物A’和B’中A’引物的序列为SEQ IDNO5，与A互补，B’引物的序列为SEQ ID NO6，与B互补。且扩增产物的长度为43bp。SEQ ID NO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测沙眼衣原体的遗传标记物，其特征在于其核苷酸顺序如ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２所示的脱氧核糖核酸顺序或其互补顺序，或者其编码的核糖核酸顺序或其互补顺序。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李超，夏懿，
申请(专利权)人：上海复星医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]