本发明专利技术涉及加工临床样品以便通过涂片显微镜检术、培养或ＰＣＲ诊断细菌性感染的方法和用于实施该方法的试剂盒。本发明专利技术还涉及两组对结核分枝杆菌的ＤｅｖＲ基因具有特异性的引物以及使用所述引物通过ＰＣＲ筛选结核病患者的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本申请描述了一种用于细菌性感染(包括结核)的多用途诊断方法学，其包括加工临床样品和将所加工的材料用于涂片显微镜检术(smearmicroscopy)、培养和聚合酶链式反应。该方法学可以应用于所有类型的肺结核和肺外结核(extra pulmonary tuberculosis)。本专利技术的背景和现有技术参考在印度和东南亚，结核比任何其它传染性疾病都造成更多的人死亡——超过HIV、STD、疟疾和热带病的组合。在印度，每天有超过1千人会死于TB——每年超过450,000人，每分钟超过1人。快速诊断结核对于提高治愈率、减少该疾病通过肺部途径扩散的危险、和对抗目前出现的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的抗药性菌株以及该疾病在HIV感染患者中的严重牵连问题，变得日益重要。导致该疾病的生物体是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。该生物的特征为生长缓慢和存在独特的富含脂质的细胞壁，该细胞壁使得其可以不受到常规抗生素和裂解方法的作用的影响。该细胞壁的耐酸性质被应用于通过涂片显微镜检术快速检测临床样品中结核分枝杆菌和其它分枝杆菌的存在。至今，涂片显微镜检术由于简单、快速、费用低以及对仪器及技术的要求最少，是目前全世界所用的所有实验室诊断结核的方法中最为流行的方法。然而，该方法缺乏灵敏度——为了通过Ziehl Neelsen染色从浓缩的样品获得阳性报告，要求大约10,000个生物/ml的样品载量(Kent和Kubica，1995)。一种同样简单但更灵敏的涂片显微镜检术对于实验室诊断将是高度有用的。培养被认为是金标准，但是考虑到该病原体缓慢的生长速率，仅仅依赖于培养将总是导致确定诊断结果的获得被延迟4-6周。除了肺结核，肺外结核由于其涉及广泛的器官并且在送至诊断实验室的样品中少菌型(paucibacillary)细菌载量，也是一项巨大的诊断挑战。核酸扩增技术由于提供了灵敏、特异而快速的替代性结核诊断方法而受到拥护。这些方法在不小的程度上受到其不能够从所有类型的临床材料中分离出足量的PCR可扩增的分枝杆菌DNA的限制。就我们所知，目前尚没有可普遍应用于所有类型的临床材料上的、使用利于环境的试剂进行的DNA分离方法。这为DNA扩增技术在临床材料上的应用构成了一个十分实际而严重的障碍。与此背景相对，一种通用方法学已经被开发出来，该方法学包括独特的样品加工技术，该技术单独可以和最常用的实验室TB诊断方法——涂片显微镜检术、培养和PCR——相容。在肺结核和肺外结核的情况下，该方法学可以应用于除了粪便物之外的所有临床材料类型。该方法利用分枝杆菌细胞壁的独特性质选择性地除去外来物质、污染性生物及潜在的PCR抑制性物质并同时对结核分枝杆菌的耐酸性、生存力和完整性不造成不利影响。盐酸胍的离液(chaotropic)性质与去污剂和中性pH缓冲液联合用于此目的。涂片显微镜检术和培养是全球最广泛使用的实验室结核诊断技术。近年来，基于核酸的技术，尤其是PCR，也被用作辅助检验以便在合理的时间期限实现确诊。就我们所知，对于涂片显微镜检术、培养和PCR，已经公开的技术和商业试剂盒及它们的缺点如下涂片显微镜检术和培养用于结核分枝杆菌的涂片显微镜检术和培养的样品的制备方法，涉及使用4％NaOH；0.5％NALC和2％NaOH(3％NaOH被推荐用于具有高度潮湿气候的热带国家)；二硫苏糖醇(DTT)和2％NaOH；13％含有或不含有苯扎氯铵(benzalkonium chloride)的磷酸三钠(Zephiran)；5％草酸；1％十六烷基氯化吡啶和2％NaCl。(Koneman等，1997)。家庭用漂白剂(NaOCl)也已经用于痰的液化处理和涂片的制备。这需要过夜沉淀和从沉淀物制备涂片。在埃塞俄比亚和印度进行的3项研究中，利用NaOCl方法使耐酸性杆菌阳性的样品数量增加了100％以上(Gebre等，1995)。但是一些研究证实，尽管漂白沉淀可以增加诊断率，但是这仅仅只达到微小的程度(Van Deun等，2000)。这些方法的基本目的均是旨在对样品进行液化和净化，并已最广泛地应用于痰样品。NALC和DTT是有效的粘液溶解剂但是价格高。净化剂如NaOH和磷酸三钠需要小心地控制暴露时间。Zephiran需要用卵磷脂中和并且与在基于卵的培养基上的接种不相容。(Koneman等，1997)。近来，描述了一种使用C18-羧基丙基甜菜碱(CB-18TM)——一种兼性离子去污剂——加工呼吸道样品以检测分枝杆菌的方法。该方法涉及弱碱性消化样品和用CB-18TM处理并随后孵育2-24小时、离心和AFB涂片检查。对于结核分枝杆菌的培养，指定一个单独的方案，其中联合使用三种分解酶和CB-18TM，该方案增加了费用。最初的研究显示，与NALC-NaOH方法相比，该方法使总的(aggregate)涂片灵敏度和培养灵敏度分别增加大约58％和43％(Thornton等，1998)。在近来的一份关于CB-18TM方法与NALC-NaOH法比较的报道中，前一方法显示出59.6％的涂片灵敏度，该灵敏度稍后在对该方案进行改进时增加至71.4％(Scott等，2002)。应当注意，通过该方法加工的样品与在液体培养基中的培养是不相容的。此产品由Quest DiagnosticsIncorporated，Baltimore，USA以CB-18TM涂片试剂盒及CB-18TMTB培养试剂盒和Lytic Decon II的形式市场销售。近来已经描述了使用壳多糖消化痰中的粘液的另一方法，该方法涉及在痰中添加壳多糖溶液、通过涡旋或振荡进行匀浆、以单位重力沉淀30分钟和从沉淀物制备涂片。这仅适于从痰实施的涂片显微镜检术。该方法的灵敏度估计为80％，特异性为96.7％(Farnia等，2002)。未评价该方法在培养中的应用。另一最近出版的方法描述了使用酚和硫酸铵的组合(PhAS)来液化痰。但这需要过夜沉淀，并且因为该方法杀死分枝杆菌故不适用于培养。该方法的灵敏度和特异性分别为85％和97％(Selvakumar等，2002)。直接的涂片方法(利用ZN和/或金胺染色)的灵敏度在不同的实验室设置下在40％至85％范围变动。浓缩步骤的包括使得该直接涂片方法的灵敏度由54-57％增加至63-80％(Bruchfeld等，2000；Garay等，2000)。此CDC方法显示出大约66至83％的灵敏度水平(Scott等，2002，Farnia等，2002，我们的研究)。据报道，离心步骤(4000g，15分钟)的包括使得可以通过涂片显微镜检术和培养分别检测到≥5000和500个生物体/ml(Perera等，1999)。然而，其它的报道提示，痰的液化和浓缩并未提高涂片显微镜检术的总体诊断灵敏度(Wilkinson等，1997)。已经提议，使用荧光显微镜检术可以极大地提高痰涂片——尤其是在可能被ZN染色涂片遗漏的具有低杆菌密度的样品中——的诊断价值(Githui等，1993)。然而，荧光显微镜检术将造成费用的增加。目前可获得的培养分枝杆菌的自动和半自动系统诊断TB的最灵敏但是耗时的方法是培养病原体。在国际市场上有几种液体和固体培养基可用于此目的。由于为了获得结论性的结本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种有效且经济的加工可用于简单、快速、安全、灵敏且准确地诊断细菌感染的临床样品的方法，该方法使用包含由通用样品加工（ＵＳＰ）溶液（由浓度３至６Ｍ的盐酸胍（ＧｕＨＣｌ）、浓度４０－６０ｍＭ且ｐＨ７．３－７．７的Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、浓度２０－３０ｍＭ的ＥＤＴＡ、浓度０．３－０．８％的十二烷基肌氨酸钠、浓度０．１－０．３Ｍ的β－巯基乙醇组成）组成的溶液１、由浓度６５－７０ｍＭ且ｐＨ６．７－６．８的磷酸钠组成的溶液２（可选择地，可以由无菌水替代）、和由浓度０．０３－０．０８％的Ｔｗｅｅｎ８０组成的溶液３、及用于分离ＤＮＡ的包含浓度８－１２％的Ｃｈｅｌｅｘ１００悬浮液的溶液Ａ、由浓度０．０２－０．０４％的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００组成的溶液Ｂ和包含浓度０．２－０．４％的Ｔｗｅｅｎ２０的溶液Ｃ（任选地，可以使用单独溶液３或具有０．０３－０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００的溶液３代替溶液Ａ、Ｂ和Ｃ从含高杆菌载量或低废料的样品分离ＤＮＡ）的组合物，所述方法包括步骤： ａ．获得临床样品， ｂ．将１．５至２体积的溶液１与样品混合， ｃ．匀浆混合物并避免起泡， ｄ．向匀浆物添加溶液２或无菌水，之后离心获得沉淀， ｅ．任选地取决于沉淀体积的减少，用溶液１洗涤沉淀， ｆ．用水洗涤经溶液１洗涤的沉淀，和 ｇ．将水洗涤后的沉淀重悬在溶液３中，以得到用于诊断的经加工样品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：JS蒂亚吉，S查克拉瓦蒂，
申请(专利权)人：全印度医学科学院，
类型：发明
国别省市：IN[印度]
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