脂连蛋白多聚体的分离测定方法技术

本发明专利技术提供分离在生物体试样中形成各种多聚体存在的脂连蛋白进行免疫学测定的方法，以及通过分离测定、获得只通过脂连蛋白的总量测定无法得到的信息、更准确地评价疾病与脂连蛋白的关系的方法。生物体试样中的脂连蛋白多聚体的分离测定方法，其特征在于，使用蛋白酶和／或抗体将作为测定对象的脂连蛋白多聚体与其它脂连蛋白分离，进行免疫学测定。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及分离生物体试样中所含的各种脂连蛋白多聚体并进行免疫学测定的方法。
技术介绍
脂连蛋白(脂联素)是由脂肪细胞特异性分泌的使胰岛素增敏的激素，在血液中以较高浓度(5～10μg/mL)存在。关于脂连蛋白的生理作用，由本专利技术者报告了，脂连蛋白量的减少是肥胖导致的II型糖尿病和脂肪萎缩性糖尿病中引起糖·脂类代谢异常的原因之一(非专利文献1)；关于医学上的应用，提出了在糖代谢异常的诊断、特别是作为胰岛素抗性改善药的噻唑烷衍生物的治疗效果的监控上的应用(专利文献1)，利用抑制肝星形细胞的活化和增殖、抑制细胞外基质产生等作用的肝纤维化抑制剂(专利文献2)。脂连蛋白被报道，在结构上属于C1q(补体1q)家族，由于具有作为C1q家族的特征的胶原样结构域，形成主要是三聚体的多聚体而存在(非专利文献2、3)。关于脂连蛋白的结构上的差异与生理作用、活性等的关系，Tsao等报告了，对于NF-κB的活化作用，只在超过三聚体的脂连蛋白多聚体中发现活性，在三聚体和胶原样结构域缺失的球状(globular)结构域中没有发现活化作用。此外，Utpal等报告了，通过投与胰岛素或葡萄糖，只有高分子部分的脂连蛋白显著地下降，将胶原样结构域的半胱氨酸转变为丝氨酸的脂连蛋白和经还原处理了的脂连蛋白的降血糖作用强，而未经还原处理的和球状的脂连蛋白几乎不表现出降血糖作用(非专利文献4)。然而，这些报告中用于研究的脂连蛋白是通过大肠杆菌等的基因重组来表达的，可能无法准确反映生物体内分泌的脂连蛋白的特征和作用。此外，已知血液中脂连蛋白的浓度存在性别差异，报告了女性与男性相比其值显著较高(非专利文献5)；另一方面，也报告了根据小鼠血清的数据，特别是高分子部分的脂连蛋白的含量较高(非专利文献4)。对于脂连蛋白的结构上的差异与生理作用、疾病与脂连蛋白的关系，由于存在只通过脂连蛋白总量的测定无法获得的信息，需要可以分离生物体试样中存在的各种脂连蛋白多聚体并进行测定的方法。作为测定脂连蛋白的方法，揭示有在将测定用的试样预先在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下进行煮沸处理后、进行免疫学测定的方法(专利文献3)。该方法是通过前述处理使立体结构上隐藏的抗体识别位点暴露、对脂连蛋白的总量进行免疫学测定的方法，无法分离各种多聚体来进行测定。此外，还揭示有将测定试样中的脂连蛋白不进行SDS变性处理或热变性处理而进行测定的方法(专利文献2中称为天然型的测定)(专利文献2)，但关于分离测定没有记载，无法应用。专利文献1国际公开WO03/016906公报专利文献2日本专利特开2002-363094公报专利文献3日本专利特开2000-304748公报非专利文献1Yamauchi T.等，Nat Med.，7，941-946，2001非专利文献2Nakano Y.等，J.Biochem.，120，803-812，1996非专利文献3Tsao T-S.等，J.Biol.Chem.，277，29359-29362，2002非专利文献4Utpal B.等，J.Biol.Chem.，278，9073-9085，2003非专利文献5Yamamoto Y.等，Clin.Sci.，103，137-142，2002专利技术的揭示专利技术要解决的课题本专利技术的目的在于提供分离在生物体试样中形成各种多聚体而存在的脂连蛋白并进行测定的方法，其目的还在于提供通过分离测定获得只通过测定脂连蛋白总量无法得到的信息、更准确地对脂连蛋白的生理作用和疾病与脂连蛋白的关系进行评价的方法。解决课题的方法本专利技术者为了解决上述课题而认真研究后发现，血液中的脂连蛋白存在根据按凝胶过滤色谱法估计的分子量，能够以150kDa以上200kDa以下(主要在160kDa附近)(以下记作LMW-Ad)、超过200kDa未满400kDa(主要在260kDa附近)(以下记作MMW-Ad)和400kDa以上800kDa以下(主要在450kDa附近)(以下记作HMW-Ad)区分的3种，进一步研究后，从人血液中成功得到了4种脂连蛋白多聚体的分离纯化样品。这4种成分可以通过采用非变性系统的聚丙烯酰胺(2-15％)的电泳(以下也记作“PAGE(2-15％)”)进行分离，从迁移率大的一侧依次记作ULMW-Ad、LMW-Ad、MMW-Ad和HMW-Ad进行区别。这4种中，LMW-Ad、MMW-Ad、HMW-Ad分别对应于前述血清中的3种脂连蛋白。而且发现，LMW-Ad在脂连蛋白三聚体中与白蛋白以二硫键结合，通过至少组合抗脂连蛋白抗体和抗白蛋白抗体的使用，可以分离测定LMW-Ad，并了解到根据分子内交联后采用SDS-聚丙烯酰胺(2-15％)的电泳(以下在方法中也记作“SDS-PAGE”)算出的分子量，ULMW-Ad是脂连蛋白的三聚体，进而推测MMW-Ad约为6-9聚体，HMW-Ad形成了MMW-Ad的2倍以上的缔合体。基于这些知识进一步发现，通过使适当的蛋白酶与含有脂连蛋白的试样作用，可以消化除HMW-Ad之外的脂连蛋白，发现采用蛋白酶的消化处理后，对残留的HMW-Ad可以使用抗脂连蛋白抗体进行分离测定。另外发现，通过对ULMW-Ad和LMW-Ad进行蛋白酶处理，算出残留的HMW-Ad量和MMW-Ad量的合计量，再从该合计量减去HMW-Ad量，可以算出MMW-Ad量；通过对ULMW-Ad和LMW-Ad进行蛋白酶处理，算出残留的HMW-Ad量和MMW-Ad量的合计量，从另外测定的脂连蛋白总量中减去HMW-Ad量和MMW-Ad量的合计量和LMW-Ad量，可以算出ULMW-Ad量。本专利技术是基于这些知识而完成的。即，本专利技术提供生物体试样中的，其特征在于，使用蛋白酶和/或抗体将脂连蛋白多聚体与其它脂连蛋白分离，进行免疫学测定。本专利技术还提供生物体试样中的脂连蛋白的测定方法，其特征在于，使用蛋白酶和/或抗体将下述4种来源于人血中的脂连蛋白多聚体中的一种或两种与其它脂连蛋白分离，进行免疫学测定。(1)ULMW-Ad将从人血清或人血浆中纯化的脂连蛋白在非变性条件下用聚丙烯酰胺凝胶(2-15％)电泳后，作为主要的染色条带检出的4种条带中，迁移率最大、且基于分子内交联后的SDS-PAGE的分子量在100kDa附近的脂连蛋白。(2)LMW-Ad将从人血清或人血浆中纯化的脂连蛋白在非变性条件下用聚丙烯酰胺凝胶(2-15％)电泳后，作为主要的染色条带检出的4种条带中，迁移率仅次于ULMW-Ad、且基于分子内交联后的SDS-PAGE的分子量在150kDa附近、并与白蛋白以二硫键结合的脂连蛋白。(3)MMW-Ad将从人血清或人血浆中纯化的脂连蛋白在非变性条件下用聚丙烯酰胺凝胶(2-15％)电泳后，作为主要的染色条带检出的4种条带中，迁移率次于LMW-Ad、且基于分子内交联后的SDS-PAGE的分子量在250kDa附近的脂连蛋白。(4)HMW-Ad将从人血清或人血浆中纯化的脂连蛋白在非变性条件下用聚丙烯酰胺凝胶(2-15％)电泳后，作为主要的染色条带检出的4种条带中，迁移率最小、且基于分子内交联后的SDS-PAGE的分子量至少在300kDa以上的脂连蛋白。此外，本专利技术提供疾病或病态的评价方法，其特征在于，将上述4种脂连蛋白中的一种或两种，使用蛋白酶和/或抗体与其它脂连蛋白分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
生物体试样中的脂连蛋白多聚体的分离测定方法，其特征在于，使用蛋白酶和／或抗体将作为测定对象的脂连蛋白多聚体与其它脂连蛋白分离，进行免疫学测定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：海老沼宏幸，矢后弘和，秋元优夏，宫崎修，门脇孝，山内敏正，原一雄，
申请(专利权)人：第一化学药品株式会社，株式会社东京大学TLO，
类型：发明
国别省市：JP[日本]