酶促化学发光底物、其合成方法及酶促化学发光底物系统技术方案

酶促化学发光底物其合成方法及酶促化学发光底物系统，属于免疫诊断技术领域。酶促化学发光底物系统由Ａ、Ｂ两组成分组成，Ａ组主要由酶促化学发光底物、增强剂、氨基酸组成，Ｂ组主要由氨基酸氧化酶和稳定剂组成，酶促化学发光底物通式为右式，其中，Ｒ↓［１］为卤素，Ｒ↓［２］为含有３－８个Ｃ原子的烷基羧酸盐、烷基磺酸盐或者烷基铵盐。本发明专利技术酶促化学发光底物系统发光信号强、持续时间长、常温保存期长。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫诊断
，特别涉及一种适用于过氧化物酶(辣根过氧化物酶HRP)或HRP标记的抗原抗体配合物痕量检测的酶促化学发光底物、其合成方法及酶促化学发光底物系统。
技术介绍
20世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行分析检测，即利用发光的化学反应(chemiluminescence，CL)和生物反应(bioluminescence，BL)分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)因灵敏度高(attomole即10-18mol)、快速、简便、测试中不使用有害、试剂，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。化学发光指化学反应引起的发光现象，发光原理是在一个反应体系中的A、B两种物质，通过化学反应生成一种激发态的产物(C*)，在其回到基态的过程中，释放出的能量转变成光子(能量hγ)，从而产生发光现象。其反应式为，(h是普朗克常数，γ为发射光子的频率)。化学发光反应的首要条件是反应体系必须提供足够的激发能，其活化焓(ΔH)应介于170～300kJ/mol之间，才能在可见光区域观察到化学发光现象；化学发光反应的第二个条件是吸收了化学能后处于激发态的分子必须以光子的形式将能量释放出来，或者将能量转移至另一个分子，使该分子被激发，当被激发的分子回到基态时，将以光子的形式释放能量。目前，酶促化学发光检测主要有两大体系。一是碱性磷酸酶(alkalinephospharase，AP)催化的AMPPD(金刚烷衍生物)发光；一是辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)催化的鲁米诺(Luminol)及其衍生物发光。由于AP较难获得高纯度制品，价格比HRP高约20倍；部分正常组织含有AP，某些病理情况下血中AP增加，也会对测定产生影响。并且AP催化AMPPD的发光反应是水解反应，发光强度较低，起光较慢，但是具有较长的平台期。目前AP所催化的底物技术仍处于专利的保护期。而HRP价廉易得，比活性可高达4500U/mg，HRP常用于生物分子、激素、肿瘤标志物的标记，约有60％的ELISA检测采用。并且HRP催化Luminol的发光反应是氧化-还原反应，该反应发光强度比AP系统有所提高，起光也较迅速，但缺点是该反应为闪光型化学发光，发光信号易衰减，一般发光在5分钟后迅速下降，30分钟后信号全部消失，直接影响其在检测中的应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种发光信号强、持续时间长、常温保存期长的酶促化学发光底物、其合成方法及酶促化学发光底物系统。为大上述目的，本专利技术采用如下技术方案酶促化学发光底物，其特征在于，其通式如下 其中，R1为卤素，R2为含有3-8个C原子的烷基羧酸盐、烷基磺酸盐或者烷基铵盐。R1为F、Cl、Br、I，R2为-(CH2)3SO3-Na+、-(CH2)N+(CH3)Br-、-(CH2)4SO3-Na+、-(CH2)3CO2H、-CH2CH(CH3)CH2SO3-Na+、-CH2CH(CH3)CH2N(CH3)3+Cl-。酶促化学发光底物合成方法，以邻二甲苯为原料，依次经过硝基化、卤化，然后在酸性条件下加入高锰酸钾氧化，生成含有卤素和硝基的邻苯二甲酸，再在苯环上引入烷基磺酸盐，生成物与肼及次硫酸盐反应制得高效发光剂。酶促化学发光底物系统，由A、B两组成分组成，A组主要由酶促化学发光底物、增强剂、氨基酸组成，B组主要由氨基酸氧化酶和稳定剂组成，酶促化学发光底物通式为 其中，R1为卤素，R2为含有3-8个C原子的烷基羧酸盐、烷基磺酸盐或者烷基铵盐。R1为F、Cl、Br、I，R2为-(CH2)3SO3-Na+、-(CH2)N+(CH3)Br-、-(CH2)4SO3-Na+、-(CH2)3CO2H、-CH2CH(CH3)CH2SO3-Na+、-CH2CH(CH3)CH2N(CH3)3+Cl-。增强剂为羟基香豆素、没食子酸或其衍生物，氨基酸为酪氨酸或色氨酸，稳定剂为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠或维生素C。酶促化学发光底物中R1＝-Cl，R2＝-(CH2)3SO3-Na+，浓度为0.2-8.0mM；增强剂为羟基香豆素或/和没食子酸，浓度分别为0.1-10mM、0.05-4.5mM；氧化剂为氨基酸和氨基酸氧化酶，浓度分别为2-40mM、5-100mM。A组还含有PH9.4的缓冲剂，B组还含有表面活性剂和PH6.5的缓冲剂。本专利技术酶促化学发光底物在苯环上引入长链烷基磺酸盐类，大大降低了氧化还原反应的活化能，起光迅速，在2分钟内达到发光平台，同时发光剂的稳定性大大增强，且易溶于水，易于配制。与化学修饰前，发光的量子效率提高了数倍。氧化剂由氨基酸及氨基酸氧化酶提供，并分别配制于A，B液中。当A，B二者混合后，产生均速的H2O2。适当调整二者的浓度，在一定的时间范围内，H2O2的产生速率可保持不变，这就使化学发光反应速率也保持稳定，故平台期大大延长(约120分钟)，这在临床应用中具有独特的优势。在HRP的催化下，底物系统发生氧化还原反应，产生光子。在B组成分中还加入了稳定剂如抗氧剂亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠或维生素C，可有效延长发光液的保存期(长达12个月)。对本专利技术进行的相对发光光子数测定试验如下化学发光仪选自AUTHOS公司的LUCY3系列化学发光仪；HRP购自SIGMA公司，RZ＞3.0；所用酶促化学发光检测试剂盒均为自产。由于该复合增强剂的加入，使发光信号大大增强。与市售某国产发光底物相比结果如下(同时用500pg SA-HRP加入100UL底物液做实验)相对发光光子数(RLU)本专利技术配制工作液 1246.53市售国产化学发光液120.25本专利技术的发光值为1246.53，某国产化学发光液的相对发光值为120.25，相对发光值增加了10.36倍。同时在发光系统中还加入了非离子表面活性剂如吐温-20及金属螯合物如DTPA、EDTA或EDTP等，可降低发光液的本底噪音。以空白酶标板孔做两种发光剂的背景信号相对发光光子数(RLU)本专利技术配制工作液8.63市售国产化学发光液 23.56两种发光液的背景噪音相比，下降了3倍。利用本高效稳定化学发光底物系统测定(TSH)试验如下应用双抗体夹心法检测血清中TSH含量。TSH由α亚基和β亚基组成。试验步骤1、包被将纯化的抗-α亚基的单克隆抗体包被于微孔板上，制成固相抗体。用0.1mol/L碳酸盐缓冲液将抗体稀释到5ug/ml，取100UL加入不透光板式微孔中，4度过夜。次日用0.01mol/LPH7.4PBS洗涤三次，加入150UL的封闭液(0.01mol/LPH7.4PBS+3％BSA+5％蔗糖)，4度过夜。次日甩干，干燥备用。2、用辣根过氧化物酶标记抗-β亚基的单克隆抗体。3、测定往包被板的微孔中加入TSH(标准品或待测样品)及酶标抗体，在37℃条件下，温育60分钟；特异性地形成“固相抗体-抗原-酶标抗体”复合物，洗去未结合的酶标抗体。4、每孔加混合后的底物100μl，室温反应5分钟。5、化学发光检测仪检测发光强度。本次实验测量结果(TSH)标准品的浓度及相应的发光值如下表 对标准浓度及本文档来自技高网...

【技术保护点】
酶促化学发光底物，其特征在于，其通式如下：　　　　＊＊＊　　　　其中，Ｒ↓［１］为卤素，Ｒ↓［２］为含有３－８个Ｃ原子的烷基羧酸盐、烷基磺酸盐或者烷基铵盐。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：付光宇，马建军，李桂林，李彬，吴学炜，杨增利，秦耘，苗兰芳，苗拥军，
申请(专利权)人：郑州安图绿科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]