本发明专利技术提供了一种新的合成喹乙醇（Ｏｌａｑｕｉｎｄｏｘ）人工抗原的方法。该方法是将喹乙醇溶解于碱性有机溶剂（ＤＭＦ、无水吡啶或三丁胺）中，然后用有机溶剂溶解的固体光气（ＢＴＣ）与喹乙醇的有机溶剂溶液混合，在适宜的条件下反应适当的时间，将活化的喹乙醇与载体溶液混合，合成喹乙醇的免疫原和包被原。所用的固体光气比传统的光气不挥发，毒性低。本发明专利技术属国际首创。该抗原用于动物免疫，获得的抗体能用于喹乙醇的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及以小分子化合物作为半抗原合成人工抗原的方法。具体而言，本专利技术涉及一种新的合成喹乙醇(Olaquindox)人工抗原的方法。更具体地说，本专利技术所述方法使用固体光气作为偶联剂(或称连接臂)，偶联喹乙醇与载体蛋白从而合成喹乙醇的人工抗原。
技术介绍
喹乙醇(Olaquindox)，又名快育灵、倍育诺(Bayonox)、奥拉金、喹酰胺醇、Fedan。分子式C-(12)H-(13)N-3甲酸甲酯-3-O-4。由2-甲基喹噁啉-1、4-二氧化物与乙醇胺缩合而成的淡黄色结晶性粉末，微溶于水。喹乙醇抗菌效力好，促进生长发育，增加瘦肉率，价格便宜。因此曾经被作为抗菌促生长作用的饲料添加剂大量使用。然而，喹乙醇在被大量使用后，人们也发现了许多问题，如鸡等禽类对喹乙醇敏感。人们对使用喹乙醇添加剂的鸡进行病理解剖时，发现鸡的脏器有药物致损的现象。喹乙醇在动物体内的残留时间长，蓄积毒性大，不仅能使动物中毒或死亡，而且残留在肉中对人体也有较大危害。由于喹乙醇是由2-甲酸甲酯-3-甲基喹噁啉-1、4-二氧化物与乙醇胺缩合而成的，有人认为喹乙醇在动物体内代谢后会生成甲基喹噁啉-1、4-二氧化物，这种物质能抑制脱氧核糖核酸的合成，对染色体畸变有影响，是一种致癌物。鉴于喹乙醇的毒性和存在的潜在危害，因而人们重新对喹乙醇的安全性进行评价，对喹乙醇的使用也做出了新的规定。美国没有批准使用；欧盟也从1999年开起始全面禁止使用喹乙醇；我国对喹乙醇使用的限制也更加严格。我国农业部颁布的《动物性食品兽药最高残留限量》中也列入了喹乙醇。国家进出口检验检疫局制定了肉中喹乙醇残留量的检验方法《中华人民共和国进出口商品检验行业标准——出口肉中喹乙饲料添加剂质量监督检测实施细则》也把鸡饲料、饮水及鱼饲料中的喹乙醇作为违禁药物进行监督检验。现有的喹乙醇检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响较大；再者这些方法需要复杂的仪器，且过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因为喹乙醇是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。喹乙醇人工抗原和特异性抗体以及在此基础上建立免疫分析方法尚未见报道。并且本专利技术首次用固体光气作为连接剂用于制备喹乙醇的人工抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供喹乙醇(Olaquindox)人工抗原及合成方法。一方面，本专利技术提供了。喹乙醇是有机小分子半抗原，必须与大分子载体偶联后才成为完全抗原。本专利技术使用固体光气(BTC)(学名双-三氯甲基碳酸酯)作为偶联试剂。固体光气以前主要用作有机化合物合成过程中的偶联剂，本专利技术将其作为合成免疫原的偶联剂。固体光气与以往合成免疫原中常用的偶联剂相比，其作为固体，因而使用方便，能准确称量，从而可以避免偶联剂过量使用产生的副反应，并且固体光气与光气相比，毒性低，容易储存。本专利技术所述的合成喹乙醇人工抗原的方法包括(a)称取喹乙醇溶于吡啶和DMF混合(1∶1)溶液中，称取固体光气(BTC)溶于二氯甲烷中，在冰浴条件下先将少许BTC溶液滴加入喹乙醇溶液中，反应几分钟后将剩余的BTC溶液全部加入，转入室温搅拌反应1小时，得到混合溶液A。称取载体蛋白溶于弱碱性的硼酸钠缓冲液中，向其中加入1ml DMF得到载体蛋白溶液B。(b)将溶液A逐滴加于载体蛋白溶液B中，缓慢滴加，半小时内加完，室温下反应4小时得喹乙醇-载体蛋白偶联物。在一个优选实施方案中，所述合成喹乙醇人工抗原的方法的具体操作为称取26.3mg喹乙醇溶于3ml的吡啶和DMF混合(1∶1)溶液中，称取固体光气(BTC)9.9mg溶于1ml二氯甲烷中，在冰浴条件下先将少许BTC溶液滴加入喹乙醇溶液中，反应几分钟后将剩余的BTC溶液全部加入，转入室温搅拌反应1小时，得到混合溶液A。称取50mg载体蛋白溶于0.1mol/LpH 8.4的5ml硼酸钠缓冲液中，向其中加入1ml DMF得到载体蛋白溶液B。将溶液A逐滴加于载体蛋白溶液B中，缓慢滴加，半小时内加完，室温下反应4小时得喹乙醇-载体蛋白偶联物。本专利技术的一个优选实施方案中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，BSA与喹乙醇之间的偶联比为1∶10。另一个优选实施方案中，所述载体蛋白为匙孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，KLH与喹乙醇之间的偶联比为1∶20。另一方面，本专利技术提供了一种制备抗喹乙醇多克隆抗体的方法，该方法包括下列步骤1)将本专利技术制备的喹乙醇-载体蛋白偶联物纯化； 2)将纯化后的喹乙醇-载体蛋白偶联物与与等量弗氏完全佐剂混合后制成乳化疫苗，进行动物初次免疫，再次免疫时以弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，两次免疫的间隔时间为三周，从第三次免疫开始，每次免疫后10天，取血进行抗体效价监测，最后一次免疫后7天取血，室温凝固2h后4℃过夜，8000r/min离心10分钟，分离出全抗血清，对全抗血清进行分离纯化后即得本专利技术所述的多克隆抗体。在一个优选实施方案中，所述的偶联物纯化具体操作为过SephadexG-25M凝胶层析纯化，用0.01M pH 7.4PBS三倍柱床体积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓缩至5ml加入到平衡好的层析柱中层析纯化偶联物，液用0.01M PBS(pH 7.4)进行洗脱。一个具体实施方案中，动物免疫时使用的动物是兔。一个具体实施方案中，所述全抗血清分离纯化为用50％饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33％饱和硫酸铵溶液沉淀两次，沉淀物用尽可能少的磷酸缓冲液溶解，经透析后再用SephadexG-25M层析除去硫酸铵，即得本专利技术所述的多克隆抗体。另一方面，本方面提供了一种抗喹乙醇的多克隆抗体，该多克隆抗体是一种以喹乙醇为半抗原制得的多克隆抗体，也可以说本专利技术的多克隆抗体是一种以半抗原-载体蛋白偶联物免疫动物，取学分离出全血清，分离纯化得到的多克隆抗体。本专利技术的多克隆抗体采用pH为7.3的磷酸缓冲液时，SDS-PAGE电泳检测纯度为98％以上。另一方面，本专利技术提供了本专利技术所述多克隆抗体在检测喹乙醇中的用途。本专利技术通过间接ELISA和间接竞争ELISA试验，对本专利技术制得的多克隆抗体进行了效价和特异性测定，试验结果表明，本专利技术的抗体效价在6000以上，并且具有良好的抗喹乙醇特异性。因此，本专利技术所述多克隆抗体可用于检测喹乙醇的残留，或者用于制备检测喹乙醇残留的试剂。附图说明图1喹乙醇紫外扫描图。图2牛血清白蛋白紫外扫描图。图3喹乙醇人工抗原紫外扫描图。提供下述实施例是为了更好地进一步理解本专利技术，而决不对本专利技术的内容和保护范围构成任何限制。实施例实施例1 免疫原的合成及免疫血清的制备1.1试剂与仪器喹乙醇(湖北中牧安达药业有限公司生产)，固体光气(BTC)(购自北京耀北生物技术有限公司)，吡啶(Pyridine，AR.WM＝79.10，含量＞99.5％，天津市科密欧化学试剂开发中心)，N，N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF，美国新泽西州ACROSORGANICS公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多克隆抗体，其特征是以小分子化合物喹乙醇为半抗原与载体蛋白偶联获得的免疫原免疫动物，取血，分离血清，纯化制得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨曙明，于洪侠，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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