本发明专利技术涉及一种中草药的鉴别方法，其特征在于通过毛细管电泳电化学分析方法指纹鉴别中草药。步骤为：配制缓冲溶液；进行中草药中活性成分标准品溶液的配制及其循环伏安实验；对检测条件进行优化，并在此优化条件下进行重现性、检测限和线性范围考察；中草药样品溶液的制备；中草药ＣＥ－ＥＤ指纹图谱的获得；通过对比标准混合溶液和实际样品中活性成分的峰高确定实际样品中活性成分的含量；通过对比活性成分的含量及所获得的ＣＥ－ＥＤ指纹图谱，鉴别中草药。本发明专利技术能够建立中草药的标准ＣＥ－ＥＤ指纹图谱，同时进行活性成分的定量检测，具有高的分离效率、低的检测限、成本低、重现性好等优点，是控制及评价中草药质量的先进方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
中草药的应用在我国已有上千年的历史，是中华民族优秀文化的结晶。中草药的分析是十分重要的，但同时也是非常复杂的。首先，种类不同的草药含有的活性成分不同；其次，同种草药的活性成分还受土壤、气候和生长阶段等因素影响，甚至是同一个草药，不同部位活性成分的含量也是不同的；再者，中草药也有一定的毒副作用。因此，如何快速、高效和方便的对中草药中的活性成分进行定性定量分析，一直是中药分析研究者努力的目标。目前，用于中药研究的方法主要是高效液相色谱(HPLC)法，而且其用于中草药的指纹分析已有专利文献报道(专利号200410014271)。此外核磁共振法指纹鉴别中草药也申请了专利(专利号200510044396)。HPLC在分析中药有效成分时，其优点是柱效较高、选择性好、适用面广等，但也存在以下不利因素(1)中药成分复杂且不甚清楚，增加了样品前处理的难度，且易造成污染，影响柱寿命；(2)每根柱的柱效实际不足1万塔板；(3)消耗溶剂量大；(4)分析时间一般较长。核磁共振法不仅能够进行定性和定量的分析，而且还能获得更多的结构信息，但其操作较复杂且仪器昂贵，从而限制了其广泛应用。与它们相比，毛细管电泳法(CE)是一种新的分离分析技术，但发展迅速，且分离效率比HPLC高，用于中药分析时具有许多优点(1)毛细管柱易清洗，不必担心柱污染而报废；(2)样品前处理简单；(3)分析时间短；(4)由于柱效高，有可能使同一分离条件适合多种样品中多组分的分析；(5)所用化学试剂少，价廉，分析成本低；(6)分离模式多，适合于中药中各类化学成分的分析。与CE联用用于检测中草药成分的主要方法是紫外光谱(UltravioletSpectrophotometry，UV)，UV检测由于其通用性较好，结构简单，是目前中草药成分分析中最广泛使用的检测方法，但其主要缺点是灵敏度不高，这主要是光程太短所造成的。而电化学检测法(ED)相对于UV法来说具有许多优点，如选择性好、灵敏度高、设备和操作简单、便于推广使用等。这样，将具有高分离效率的CE与高灵敏度的ED结合起来用于指纹鉴别中草药对于保证入药所用的草药的真伪、质量、安全和药效是非常有利的。但迄今为止，还没有CE-ED法指纹鉴别中草药的文献以及专利报道。
技术实现思路
为了解决上述现有技术的不足，本专利技术提供一种新的中草药的指纹鉴别方法，其特征在于通过毛细管电泳电化学分析方法鉴别中草药。这是一种仪器廉价、操作简单及快速和灵敏的分析方法，是将中草药指纹图谱分析与活性成分含量测定相结合从而控制及评价中草药质量的方法。本专利技术的方法分以下几个步骤为了保证分离和检测结果的重现性，分离毛细管和电极的处理是十分重要的1)、分离毛细管和电极的处理(1)毛细管处理毛细管在第一次使用前，通0.1mol L-1NaOH水溶液过夜。在操作过程中，为了保证分析结果的重现性，每次进样间，用1-3min二次水、4-6min缓冲溶液冲洗毛细管；(2)电极的处理当分析标准品溶液时，操作前将碳纤维微盘电极(CFE)超声0.5-1.5min，其可以使用至少1周；每次操作前将电极超声外，还要将电极在缓冲溶液中循环扫描10-30周(-0.2V-1.2V)进行活化；2)、缓冲溶液的配制pH≥9.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)用1.0mol L-1NaOH调pH值，pH值＜9.5的PBS缓冲溶液的配制是直接混合Na2HPO4和NaH2PO4的水溶液即可；3)、中草药中活性成分标准品溶液的制备及其循环伏安实验活性成分标准品溶液的制备将活性成分标准品用甲醇溶解配制成3-8mol L-1的溶液；活性成分标准品溶液的循环伏安实验将33μm CFE在含有标准品的PBS溶液中循环扫描，考察其循环伏安行为；4)、检测条件的优化，并在此优化条件下进行重现性、检测限和线性范围的考察检测条件的优化在1.0-1.3V间变化检测电位、5-50mmol L-1间变化缓冲溶液浓度、7-11间变化缓冲溶液pH值、5-40s间变化进样时间和5-22.5kV间变化分离电压考察对峰电流、迁移时间、分离度和分离效率的影响；5)、中草药样品溶液的制备用带有20-80目筛子的植物粉碎机粉碎草药样品，称取0.3-0.8g的草药样品用甲醇浸泡10-18h，然后水浴超声30-60min，之后2000-3500rpm离心5-10min，此萃取过程再重复1-3次，最后，萃取液定容于5-10mL的甲醇中；进样前，所有的样品溶液均用0.22μm的纤维素酯膜过滤并稀释到所需要的浓度进行分析；6)、中草药CE-ED指纹图谱的获得中草药CE-ED指纹图谱的获得是在步骤4)中所获得的最佳条件下进行电泳分析得到的；7)、对比标准混合溶液和实际样品中活性成分的峰高确定实际样品中活性成分的含量；8)、对比所获得的CE-ED指纹图谱，分别从几个不同的指纹片段鉴别同种植物的不同部位以及不同种植物，从而鉴别中草药及其混淆品。本专利技术的与其它中草药分析方法相比，其优点在于(1)CE的显著特点是简单、高效、快速和微量只需一根廉价的毛细管、一个微盘工作电极、直流高压仪器(±30kV)、电化学分析仪和一些常用试剂即可；通常CE完成一个检测过程只要几分钟到十几分钟，并且可以得到高达几十万/米的理论塔板数；采样体积通常只有几纳升，特别是在分析有毒样品时，对环境影响很小。(2)毛细管通常是由石英玻璃制成，可以经受强碱、强酸的清洗，在复杂的中草药样品的测定中，有利于柱中样品杂质的清除。(3)电化学检测与其它检测方法相比，由于其只对电活性组分有响应，所以其选择性好。另外，安培检测的检测限低，通常可达到10-8mol L-1，线性范围达2-3个数量级。附图说明图1是马兜铃植物的根、径叶和果实(即a青木香；b马兜铃；c天仙藤)的CE-ED指纹图谱对比；图中I和II分别是指纹片段I和II。图2是三种木通(即d关木通；e川木通；f木通)的CE-ED指纹图谱对比；图中I、II和III分别是指纹片段I、II和III。具体实施例方式本专利技术以马兜铃植物和三种木通为例，结合实施例作进一步说明。在马兜铃属和细辛属植物中发现的马兜铃酸(AAs)(包括马兜铃酸I和II，即AA-I和AA-II)具有硝基菲羧酸的结构，在中草药中具有利尿和止痛的作用。然而过量的摄入，由马兜铃属植物所制的保健品、减肥药和中草药中AAs可以导致严重的肾损伤。近年来，由于食用含有AAs的广防己所制的减肥药引发了很多的中毒事件，因此引起世界各国的高度重视。美国食品和药品管理局颁布了含有AAs的草药制剂信息以防中毒事件的进一步发生。关木通、广防己和青木香由于含有大量的AAs而从2005年版的《中华人民共和国药典》中删除，不再药用。因此，定量分析药草及其产品中AAs的含量是非常重要的。实施例1马兜铃植物不同部位的定量检测及指纹鉴别分析植物马兜铃的果实、径叶和根都是草药，它们分别叫做马兜铃、天仙藤和青木香。(1)缓冲溶液的配制，其具体方法是pH值为9.5、10.0、10.5和11.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)用1.0mol L-1NaOH调节，pH值为7.0、8.0和9.0的缓冲溶液的配制是直接混合Na2HPO4和NaH2PO4的水溶液即可。(2)AAs标准品溶液的制备及其循本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种中草药的鉴别方法，其特征在于通过毛细管电泳电化学分析方法指纹鉴别中草药，其步骤和条件如下：１）、分离毛细管和电极的处理（１）毛细管处理：毛细管在第一次使用前，通０．１ｍｏｌＬ↑［－１］ＮａＯＨ水溶液过夜，在操作过 程中，为了保证分析结果的重现性，每次进样间，用１－３ｍｉｎ二次水、４－６ｍｉｎ缓冲溶液冲洗毛细管；（２）电极的处理：当分析标准品溶液时，操作前将碳纤维微盘电极（ＣＦＥ）超声０．５－１．５ｍｉｎ；每次操作前将电极超声外，还要将 电极在缓冲溶液中循环扫描１０－３０周（－０．２Ｖ－１．２Ｖ）进行活化；２）、缓冲溶液的配制ｐＨ≥９．５的磷酸盐缓冲溶液（ＰＢＳ）用１．０ｍｏｌＬ↑［－１］ＮａＯＨ调ｐＨ值，ｐＨ值＜９．５的ＰＢＳ缓冲溶液的配制是直接混合Ｎａ↓ ［２］ＨＰＯ↓［４］和ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］的水溶液即可；３）、中草药中活性成分标准品溶液的制备及其循环伏安实验活性成分标准品溶液的制备：将活性成分标准品用甲醇溶解配制成３－８ｍｏｌＬ↑［－１］的溶液；活 性成分标准品溶液的循环伏安实验：将３３μｍＣＦＥ在含有标准品的ＰＢＳ溶液中循环扫描，考察其循环伏安行为；４）、检测条件的优化，并在此优化条件下进行重现性、检测限和线性范围的考察检测条件的优化：在１．０－１．３ Ｖ间变化检测电位、５－５０ｍｍｏｌＬ↑［－１］间变化缓冲溶液浓度、７－１１间变化缓冲溶液ｐＨ值、５－４０ｓ间变化进样时间和５－２２．５ｋＶ间变化分离电压考察对峰电流、迁移时间、分离度和分离效率的影响；５）、中草药样品溶液的制备 用带有２０－８０目筛子的植物粉碎机粉碎草药样品，称取０．３－０．８ｇ的草药样品用甲醇浸泡１０－１８ｈ，然后水浴超声３０－６０ｍｉｎ，之后２０００－３５００ｒｐｍ离心５－１０ｍｉｎ，此萃取过程再重复１－３次，最后，萃取液定容于５－１０ｍＬ的甲醇中；进样前，所有的样品溶液均用０．２２μｍ的纤维素酯膜过滤并稀释到所需要的浓度进行分析；６）、中草药ＣＥ－ＥＤ指纹图谱的获得中草药ＣＥ－ＥＤ指纹图谱的获得是在步骤４）中所获得的最佳条件下进行电泳分析得到的；７）、 对比标准混合溶液和实际样品中活性成分的峰高确定实际样品中活性成分的含量；８）、对比所获得的ＣＥ－ＥＤ指纹图谱，分别从几个不同的...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：由天艳，周晓光，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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