纯化百日咳毒素的方法及其中有用的肽技术

本发明专利技术涉及纯化百日咳毒素（ＰＴ）的试剂和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及到纯化百日咳毒素(PT)的试剂和方法。
技术介绍
百日咳毒素(PT)由百日咳杆菌(Bordetella pertussis)产生，是所有预防百日咳的疫苗的主要成分，通常情况下，PT与破伤风毒素和白喉毒素联合使用。通常通过在一定的培养基内培养百日咳杆菌，然后分离出上清中的PT，再用已知技术进行纯化来实现PT的工业化生产(即，美国专利号6,399,076；5,877,298；和Sekura等.J.Biol.Chem.25814647-14651，1983；Bogdan等.Appl.Env.Micro.69(10)6272-6279，Oct.2003)。大多数已知的方法都需要用到牛胎球蛋白(BF)或去唾液酸胎球蛋白结合的基质，它们的来源和纯度非常关键。使用牛来源的试剂也带来了对牛相关疾病如牛海绵状脑病(BSE)的担忧。于是本领域的技术人员期望有一种无需依靠BF的方法来纯化PT，其中Bogdan等描述了一个这样的方法(Appl.Env.Micro.69(10)6272-6279，Oct.2003)，通过噬菌体展示系统确认了具有模拟牛胎球蛋白的糖苷部分与PT结合能力的肽，三个具有共同序列XGSFSGF(X为任何氨基酸)的肽(3GFNGSGSGF；3G8NGSFSGC；3G2DGSFSGF)被确认具有PT结合能力。3G2还被用于亲和层析柱以纯化经部分纯化的PT制剂。其他设计和使用肽而不用牛来源的产品来纯化PT的方法为本领域技术人员所期待。这里提供的亲和纯化PT的试剂和方法不涉及到任何形式的肽球蛋白的使用。附图简述附图说明图1.A)匙羹藤抑甜味肽(gurmarin)文库示意图，文库中翻译成氨基酸序列的位置被突出显示，蛋白部分(59个氨基酸长度)的序列用单字母氨基酸码表示，其中X代表任何氨基酸。文库中不被翻译的位置用灰色方框表示。(a)T7启动子，用于文库的体外最适转录，(b)TMV-烟草花叶病毒的翻译启动序列，用于文库的体外理想翻译，(c)His6-tag，用于PROfusionTM文库的有效亲和纯化，(d)结构性的柔性接头，(e)带有两个分别含有5个和9个氨基酸的随机环状结构的匙羹藤抑甜味肽核心，(f)结构性的柔性接头和(g)与嘌呤霉素受体分子有效结合的最佳接头。B)匙羹藤抑甜味肽PROfusionTM文库的构建是一个多步骤的过程，包括以下反应PCR、体外转录、RNA与嘌呤霉素寡核苷酸接头的化学连接、体外翻译、寡-dT纯化、逆转录和His-tag纯化。图2.PROfusionTM选择循环示意图。图3.筛选出的应该进行PT结合活性测试的匙羹藤抑甜味肽变异体。保守基序用有色方框突出表示。图4.经过PT 4轮筛选的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各个变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区和匙羹藤抑甜味肽支架结构的恒定区被突出标出。随机环状结构1和2的位置被指明。图5.经过PT(环氧)5a轮筛选的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各个变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区和匙羹藤抑甜味肽支架结构的恒定区被突出标出。随机环状结构1和2的位置被指明。图6.经过PT(strep)5b轮筛选的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各个变异体的序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区和匙羹藤抑甜味肽支架结构的恒定区被突出标出。随机环状结构1和2的位置被指明。图7.经过PT(strep)6a轮筛选的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各个变异体的序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区和匙羹藤抑甜味肽支架结构的恒定区被突出标出。随机环状结构1和2的位置被指明。图8.经过PT(strep)6b轮筛选的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各个变异体的序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区和匙羹藤抑甜味肽支架结构的恒定区被突出标出。随机环状结构1和2的位置被指明。图9.筛选出的将进行PT结合活性测试的PP26变异体。保守基序被突出标出。图10.经过PT 4轮筛选的PP26的序列分析。各变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区被突出标出。图11.经过PT(环氧)5a轮筛选的PP26的序列分析。各变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区用淡黄色的方框标示，保守基序被突出标出。图12.经过PT(strep)5b轮选择的PP26的序列分析。各变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区用淡黄色的方框标示，保守基序被突出标出图13.经过PT(strep)6a轮选择的PP26的序列分析。各变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区用淡黄色的方框标示，保守基序被突出标出。图14.经过PT(strep)6b轮选择的PP26的序列分析。各变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区被突出标出。图15.生物素标记的合成的核心肽被固化到链霉亲和素琼脂糖凝胶上，求证其与纯化的PT结合。取1/40结合反应后的上清通过12％的NuPage凝胶用MES电泳缓冲液(running buffer)进行分离来对未结合的PT组分进行分析(上面的凝胶)，取50％的洗脱液通过12％的NuPage凝胶用MES电泳缓冲液进行分离来分析与琼脂糖结合的PT(下面的凝胶)，用银染的方法着色显示。一定量的纯化的PT被用作定量的标准，匙羹藤抑甜味肽15和9除外。图16.从样品A(左凝胶)和样品B(右凝胶)纯化PT。取50％的洗脱液通过12％的NuPage凝胶用MES电泳缓冲液进行分离来分析琼脂糖结合的PT(下面的凝胶)，用银染的方法着色显示。一定量的纯化的PT被用于定量的标准，匙羹藤抑甜味肽9除外。图17.结合到固定化的肽pp26克隆9和克隆15和匙羹藤抑甜味肽克隆9和匙羹藤抑甜味肽克隆15的来自样品A或B的PT的洗涤条件的优化，用50mM Tris/HCl，pH 7.5或50mM乙酸盐，pH 6进行3次洗涤，PT用12％的Bis Tris凝胶分析并用银染法着色显示。PPM为蛋白完美标记(protein perfect marker)。图18.结合到固定化的肽pp26克隆9和克隆15的来自样品B的PT的洗涤条件的优化，用50mM Tris/HCl，pH 7.5或50mM乙酸盐，pH 6进行3到20次洗涤，PT用12％的Bis Tris凝胶分析并用银染法着色显示。图19.用含0.2到2.0M MgCl2的50mM Tris/HCl从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上洗脱PT，肽结合的PT经过用所指定的洗脱缓冲液(每次20μl)连续3次洗脱后从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上置换出，残留的物质继之用凝胶上样缓冲液洗脱。所有洗脱物用12％的Bis Tris凝胶(1x MES电泳缓冲液)分析并用银染法着色显示。图20.在酸性(50mM甘氨酸，pH2.5)或碱性(100mM碳酸盐缓冲液，pH 10.5)条件下从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上洗脱PT。肽结合的PT经过用所指定的洗脱缓冲液(每次40μl)连续3次洗脱后从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶(20μl含约200pmol的肽)上置换出，残留的物质继之用凝胶上样缓冲液洗脱。所有洗脱物用12％的Bis Tris凝胶(1xMES缓冲液)分析并用银染法着色显示。取1/40体积的肽链霉亲和素琼脂糖凝胶与样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有能力结合百日咳毒素的肽，所述肽选自：　　　　ＲＳＳＨＣＲＨＲＮＣＨＴＩＴＲＧＮＭＲＩＥＴＰＮＮＩＲＫＤＡ（ｐｐ２６－５）；　　　　ＲＳＴＭＮＴＮＲＭＤＩＱＲＬＭＴＮＨＶＫＲＤＳＳＰＧＳＩＤＡ（ｐｐ２６－６）；　　　　ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ（ｐｐ２６－９）；　　　　ＲＳＷＲＤＴＲＫＬＨＭＲＨＹＦＰＬＡＩＤＳＹＷＤＨＴＬＲＤＡ（ｐｐ２６－１５）；　　　　ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＡＲＷＤＬＶＣＣＥＰＬＥＣＩＹＴＳＥＬＹＡＴＣＧ（Ｇ－９）；　　　　ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＥＬＡＶＤＥＣＣＥＰＬＥＣＦＱＭＧＨＧＦＫＲＣＧ（Ｇ－１０）；　　　　ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＳＱＳＶＰＭＣＣＥＰＬＥＣＫＷＦＮＥＮＹＧＩＣＧＳ（Ｇ－１５）；和　　　　ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＥＬＡＩＤＥＣＣＥＰＬＥＣＴＫＧＤＬＧＦＲＫＣＧ（Ｇ－１９）。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A容布卢特，E施奈德，P瓦纳，
申请(专利权)人：圣诺菲帕斯图尔公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]