丙型肝炎病毒抗体自身红细胞凝集检测方法技术

本发明专利技术涉及一种丙型肝炎病毒（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　　Ｃ　　ｖｉｒｕｓ简称ＨＣＶ）抗体检测方法。属疾病诊断领域中血清（浆）中抗体的自身红细胞凝集检测方法。通过基因工程方法或化学偶联方法将ＨＣＶ抗原（简称ＨＣＶＡｇ）与人红细胞单链抗体或人红细胞单克隆抗体进行偶联，得到一种既能与红细胞结合又能与丙型肝炎病毒抗体结合的双功能试剂，该双功能试剂以患者自身的外周血红细胞为指示物，来检测人外周血ＨＣＶ抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人红细胞单克隆抗体制备及其与丙型肝炎病毒基因工程抗原(以下简称HCVAg)偶联的方法，属疾病诊断领域中全血、血清、血浆中抗体的红细胞凝集检测法。
技术介绍
丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起，呈全球性流行，感染率约3％。我国一般人群感染率为3.2％，长江以北为3.6％，中南和东北地区分别高达3.8％和4.6％。丙型肝炎的危害在于HCV感染后自发痊愈病例极少，慢性化率可高达60％～85％。其后果是导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，容易转化为肝硬化、肝细胞癌(HCC)等终末期肝病，预后差。目前，国内临床用血检测、体检等对丙肝病毒抗体检测试剂的年需求量约在1亿人份，国外年需求量约在4-5亿人份。已知酶联免疫固相分析(ELISA)双抗原夹心法检测抗体时，标记抗原需进行酶标记，普遍使用的方法是将标记抗原的游离氨基与酶被活化后的醛基进行偶联，或通过双功能基团如戊二醛将标记抗原和酶的游离氨基进行偶联，形成共价结合的酶标抗原。酶标抗原与包被抗原组成双抗原夹心法试剂盒，可以对血清(浆)中的IgG、IgM同时进行检测，其优点是一、灵敏度高，血清(浆)不需稀释或稀释倍数少(通常只需1∶1或1∶2稀释)；二、检出率高，IgM通常在感染早期出现，可实现早期诊断，缩短检测的窗口期；三、特异性强，与间接ELISA相比，包被与标记抗原全为特异性的抗原，可减少非特异性反应。目前用该方法制备的商品化试剂盒有乙肝表面抗体双抗原夹心法ELISA试剂、人类免疫缺陷病毒抗体(I+II型)双抗原夹心法ELISA试剂等。但是，到目前为止，HCVAb的酶免检测仍然使用间接ELISA法，酶标记物为酶标抗人IgG或酶标抗人IgM，其主要原因是HCV核心区抗原富含赖氨酸和精氨酸(提供游离氨基的氨基酸)。如果按HCVAg∶酶＝1∶1的比率进行标记，HCVAg与酶的偶联位置绝大多数发生在HCVAg的核心区，而不是象其它抗原那样随机分布，酶与HCVAg核心区的游离氨基结合后形成空间位阻，妨碍HCVAg核心区抗原决定簇与其相对应的这一部分抗体结合，而HCVAg核心区又是HCVAg的优势抗原决定簇；这样，直接标记HCVAg组成的双抗原夹心法HCVAb ELISA检测试剂通常会漏检HCVAg核心区抗体阳性标本。而HCVAb间接ELISA试剂本身又有不可克服的缺点首先，灵敏度低，因为酶标记物为酶标抗人IgG或酶标抗人IgM，为了避免人IgG或IgM非特异性吸附，血清(浆)标本必须1∶10或1∶20以上进行稀释，与不需稀释血清(浆)标本的双抗原夹心法比反应灵敏度自然低10～20倍，容易造成漏检。第二，特异性差，即使血清(浆)经过1∶10～1∶20稀释，个别标本中的IgG或IgM仍对包被反应板有非特异性吸附或对包被反应板中的杂蛋白有特异性吸附。而抗人IgG或抗人IgM酶标对特异性吸附的HCV抗体和其它方式吸附的人IgG或IgM无分辩能力，必然造成一部分假阳性。第三，一般情况下不能或不方便使用一套试剂同时检测IgG和IgM，目前商品化HCVAb间接ELISA法检测试剂盒绝大多数只检测IgG，这样有可能造成一部分单独IgM阳性标本的漏检。第四，间接ELISA试剂只能检测血清(浆)，检测过程需要特殊的仪器设备，技术要求相对较高，不利于现场筛查，也很难普及到基层医疗单位。红细胞凝集试验又称血凝试验，是一种以红细胞作为反应指示物的免疫测定技术，这种由来已久的免疫学方法因其操作简便、不需仪器设备而广泛应用于基层医院，但因其灵敏度问题逐步被淘汰。1988年，澳大利亚学者将抗人红细胞单克隆抗体的Fab’片段与HIV的合成肽抗原偶联，得到一种双功能化学交联物，以患者自身的外周血红细胞为指示物，建立了一种称为自身红细胞凝集试验的检测方法，该检测方法用于检测人外周血HIV抗体，其灵敏度和特异性类似于ELISA，整个检测过程仅需2分钟，是一种非常简单方便的快速免疫测定技术。近年，Lalley等应用分子生物学技术构建了重组红细胞单链抗体。其方法是将红细胞单链抗体基因与HIV-1的gp41基因融合，构建重组质粒，并将重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达后产生双功能试剂。该双功能试剂由红细胞膜蛋白抗体重链可变区(Vh)和轻链可变区(VL)组成，其间由linker相连，在轻链可变区末端连有gp41。自身红细胞凝集试验与一般间接血凝试验不同之处为反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。主要试剂材料为人红细胞的单克隆抗体，这种抗体能与所有血型的红细胞结合，但不引起凝集反应。这种抗体与另一特异性抗体连接形成的双功能抗体可用于检测标本中的抗原；如与特异性抗原连接，则可用于检测标本中的抗体。反应中的标本为受检者的全血。反应步骤为将一滴全血置于一凹面玻璃板上，然后加入一滴双功能试剂，轻轻振摇2分钟后观察是否出现红细胞凝集。自身红细胞凝集试验除了可以用于测定大分子蛋白(如抗原抗体)，还可以用来测定药物等小分子。自身红细胞凝集试验最大特点在于其简单性和快速性，对检测标本要求不高，一次仅需一滴全血。理论上，只要患者红细胞上特异性抗原不致因患病而丧失就不会影响该方法检测。在某些特定情况下，如仅贮存有或收集到患者血清，也可以加入O型血红细胞进行检测。自身红细胞凝集试验敏感性和特异性不亚于ELISA，且可同时检测IgG和IgM，具有安全、快速、准确、价廉的特点，检测时无需分离血清，无需仪器设备，仅需一滴全血，在2分钟内可得到检测结果，非常适合条件简陋的基层医院、义务献血前以及紧急输血前的使用，因而具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是将丙肝基因工程抗原或多肽抗原同抗人红细胞单克隆抗体或基因工程单链抗体相偶联，形成双功能试剂，研制出无须任何仪器，可在2-3分钟内快速检测出是否感染HCV的丙肝病毒抗体自身红细胞凝集微量全血检测试剂，克服间接ELISA法特异性差，必需分离血清，必需仪器设备及IgG、IgM不能同时检出的弊端。本专利技术是这样实现的首先利用单克隆抗体制备技术得到高效价、高特异性的血红细胞单克隆抗体，并用蛋白酶和巯基类试剂将其修饰成Fab’片段；或利用基因工程的技术手段从血红细胞单克隆抗体细胞获得单链抗体基因并进行表达获得单链抗体。在戊二醛或其他试剂的作用下将红细胞单抗Fab’片段或红细胞单链抗体同HCV抗原偶联，得到红细胞单抗Fab’-HCV抗原双功能试剂；或利用基因工程的方法直接获得具有双功能的HCV抗原和红细胞单链抗体的融合蛋白。这些双功能试剂均可与人外周血红细胞反应，但不出现红细胞凝集现象。人血中如存在HCV抗体，则由于HCV抗体与双功能试剂发生交联反应而出现肉眼可见的红细胞凝集，即为HCV抗体阳性；人血中如不存在HCV抗体，则不出现红细胞凝集，即为HCV抗体阴性。本专利技术的积极效果一、简便快速建立了HCV微量全血自身红细胞凝集试验的检测方法，用于检测人外周血HCV抗体，其灵敏度类似于ELISA，整个检测过程仅需2分钟，且无需任何仪器设备，是一种甚为简单方便的快速免疫测定技术。二、特异性强由于采用丙肝基因工程抗原或多肽抗原同人红细胞单克隆抗体或基因工程单链抗体相偶联，间接ELISA检测法中一些不可避免的非特异性标本绝大多数可被排除，提高临床诊断的准确度。三、成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙型肝炎病毒抗体红细胞凝集检测方法，其特征为：用基因工程或化学偶联的方法将人红细胞单克隆抗体或人红细胞单链抗体和丙型肝炎病毒基因工程抗原或合成肽抗原结合在一起，形成双功能试剂，以待测全血标本中的自身红细胞作为指示系统，直接检测全血标本中的丙型肝炎病毒抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李晨阳，李玉林，陈小科，
申请(专利权)人：河南省生物工程技术研究中心，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]