本发明专利技术提供了荧光强度根据杂交互补链的相应碱基种类而变化的新的核苷酸衍生物，作为单链核苷酸序列的成员存在，当该单链核苷酸序列的杂交互补链的相应碱基是，腺嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胸腺嘧啶／尿嘧啶衍生物（１）；鸟嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胞嘧啶衍生物（２）；胞嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物（３）；胞嘧啶或胸腺嘧啶／尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的鸟嘌呤衍生物（４）；或胸腺嘧啶／尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物（５）。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于确定核苷酸序列中的特定碱基种类的核苷酸衍生物，以及具备含有该核苷酸衍生物的捕获探针的DNA微阵列。
技术介绍
随着迎来后基因组时代，对正确、高效，进而以低成本检测核苷酸序列中的碱基种类的新技术提出了要求。例如，SNP(Single NucleotidePolymorphism单核苷酸多态性)是以约0.1％(约1000个碱基中的1个)的比例存在于人类基因组的频率最高的多态性，它的有无与各种疾病有关这一事实逐渐变得明了化(例如与肺癌有关的p53基因的SNP非专利文献1)，从而以诊断或遗传治疗方法等为目的，正确判定SNP的有无的技术(SNP分型)也就变得越来越重要。作为SNP分型方法，已知有“利用杂交效率的方法”、“利用酶识别效率的方法”、“利用电技术的方法”等，特别是利用杂交效率的方法，对其在DNA微阵列(例如参考专利文献1～4，非专利文献2、3)方面的应用进行了各种研究，例如非专利文献4中报道了使用了DNA微阵列(微阵列)的BRCAl基因SNP的检测例。但是，以前的DNA微阵列仅限于SNP的检测，通常利用荧光等标记目标核苷酸序列，以荧光信号作为指标，检测与微阵列的捕获探针杂交的目标核苷酸序列。因此，例如目标核苷酸序列的制备中，利用使用了标记dNTP的PCR扩增等手段，但是这需要很多的劳动力、时间和费用。另外，SNP等的检测中，一般采用以探针与目标核苷酸序列杂交的解链温度作为指标的方法，这种情况下，需要严密设定每个目标核苷酸的杂交的严格度(stringency)条件，另外，即使通过设定这样的条件也存在着无法避免错误杂交等引起的测定误差的不良情况。另一方面，已知使荧光分子结合在天然的核酸碱基上的荧光修饰核酸碱基，例如非专利文献5中，提出了使荧光信号强度根据杂交互补链的环境而变化的荧光探针的利用。专利文献1美国专利第5,474,796号说明书专利文献2美国专利第5,605,662号说明书专利文献3国际公开第95/25116号小册子专利文献4国际公开第95/35505号小册子非专利文献1Biros et al.Neoplasma 48(5)407-11，2001非专利文献2Schena，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9310614-10619，1996非专利文献3Heller，R.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.942150-2155，1997非专利文献4Hacia JG et al.Nat.Genet.14441-447，1996非专利文献5Yamane，A.，Nucleic Acids Res.30(19)e97，2002
技术实现思路
如上所述，为了确定SNP检测等中的碱基种类，特别是考虑到在DNA微阵列中的适用的情况，寻求一种不需要利用荧光等标记目标核苷酸序列的操作，而且不依赖于解链温度测定等间接性指标的新方法。从这样的观点考虑，使用了荧光修饰核酸碱基的探针(例如非专利文献5)，在能够以探针侧荧光信号的变化作为指标直接确定碱基种类的方面上，是有效的方法。但是，该非专利文献5的方法是，以与荧光修饰核酸碱基配对的碱基种类的周边的环境(特定的碱基序列等)相应的荧光信号作为指标，而不是荧光信号根据单个碱基的种类而发生变化。本申请的专利技术是鉴于如上所述的情况而进行的，目的是提供荧光信号强度根据杂交互补链的相应碱基种类而变化的新的核苷酸衍生物。本申请的专利技术还提供使用了上述核苷酸衍生物的确定碱基种类的方法，和以该方法作为测定原理的DNA微阵列。本申请的第1专利技术为，一种核苷酸衍生物，其为在嘧啶碱基或嘌呤碱基上经由连接臂(linker)结合了荧光色素嵌入剂的核苷酸衍生物，作为单链核苷酸序列的成员存在，当该单链核苷酸序列的杂交互补链的相应碱基是腺嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)；鸟嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胞嘧啶衍生物(2)； 胞嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物(3)；胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的鸟嘌呤衍生物(4)；或胸腺嘧啶/尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物(5)。在该第1专利技术中，所说的“核苷酸衍生物”是，在嘌呤或嘧啶以β-N-糖苷键与糖结合的核苷的磷酸酯即核苷酸(ATP、GTP、CTP、UTP；或dATP、dGTP、dCTP、dTTP)的任意位置上，经由亚烷基链结合荧光色素嵌入剂而成的化合物。另外，该核苷酸衍生物“作为单链核苷酸序列的成员存在”是指，在3个核苷酸以上的核苷酸序列中的非端部位置上，核苷酸衍生物与其左右的核苷酸形成磷酸二酯键的状态。进一步，所说的“荧光色素发光最强”的意思是，例如用荧光分光光度计测定时，例如胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物的情况，与相应的碱基种类是鸟嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶/尿嘧啶的情况相比，腺嘌呤的情况可以得到最强的荧光信号强度。这里，在以下的说明中有时将“胸腺嘧啶/尿嘧啶”简单地记为“尿嘧啶(U)”或“胸腺嘧啶(T)”。该第1专利技术的具体例子为，以下的通式(1)表示的胸腺嘧啶衍生物(1) (1)以下的通式(2)表示的胞嘧啶衍生物(2) (2)以下的通式(3)表示的腺嘌呤衍生物(3) (3)以下的通式(4)表示的鸟嘌呤衍生物(4) (4)以及，以下的通式(5)表示的腺嘌呤衍生物(5)。 (5)另外，本申请的第2专利技术为，上述各核苷酸衍生物的前体物质的具体例子，各自为以下的核苷衍生物。胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)的前体物质，以下的通式(6)表示的核苷衍生物。 (6)胞嘧啶衍生物(2)的前体物质，以下的通式(7)表示的核苷衍生物。 (7)腺嘌呤衍生物(3)的前体物质，以下的通式(8)表示的核苷衍生物。 (8)鸟嘌呤衍生物(4)的前体物质，以下的通式(9)表示的核苷衍生物。 (9)腺嘌呤衍生物(5)的前体物质，以下的通式(10)表示的核苷衍生物。 (10)这里，在以上的通式(1)～(10)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。本申请的第3专利技术为，具有从上述第1专利技术的核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)组成的群中选出的一个以上的核苷酸衍生物作为成员的单链核苷酸序列。该第3专利技术的单链核苷酸序列中，可以是任一种核苷酸衍生物存在多个，或者也可以是两种以上的核苷酸衍生物各自存在一个，或各自存在多个。其中，如上所述，该单链核苷酸序列中，核苷酸衍生物不存在于序列的端部。本申请的第4专利技术为碱基种类确定方法，其为确定所述第3专利技术的单链核苷酸序列杂交互补链上的单个碱基种类X的方法，当单链核苷酸序列中的(i)胸腺嘧啶衍生物(1)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为腺嘌呤；(ii)胞嘧啶衍生物(2)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为鸟嘌呤；(iii)腺嘌呤衍生物(3)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为胞嘧啶；(iv)鸟嘌呤衍生物(4)的荧光色素发光最强时，确定碱基种本文档来自技高网...
【技术保护点】
核苷酸衍生物，其为在嘧啶碱基或嘌呤碱基上经由连接臂结合了荧光色素嵌入剂的核苷酸衍生物，作为单链核苷酸序列的成员存在，当该单链核苷酸序列的杂交互补链的相应碱基是 腺嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胸腺嘧啶／尿嘧啶衍生物（１）； 鸟嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胞嘧啶衍生物（２）； 胞嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物（３）； 胞嘧啶或胸腺嘧啶／尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的鸟嘌呤衍生物（４）；或 胸腺嘧啶／尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物（５）。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：斋藤烈，冈本晃充，斋藤义雄，吉田安子，丹羽孝介，
申请(专利权)人：日本碍子株式会社，斋藤烈，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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