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乳腺癌淋巴结转移快速免疫组化检测试剂及其检测方法技术

技术编号:2583312 阅读:308 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术公开了一种乳腺癌淋巴结转移快速免疫组化检测试剂及应用该试剂的检测方法,通过将直接标记的可将转移癌细胞与淋巴结固有细胞区别开来的多种抗体混合成试剂,经一步反应,特异性使淋巴结中的转移癌细胞着色。本发明专利技术用于早期乳腺癌前哨淋巴道转移快速病理诊断,旨在提高前哨淋巴结转移癌诊断的灵敏度、准确度,推动乳腺癌前哨淋巴结快速病理检查的广泛应用,为早期乳腺癌制定手术方案提供依据。以此解决由于常规病理检查手段灵敏度低、特异性差、操作繁琐,带来冰冻活检假阴性率高,制约前哨淋巴结临床应用的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于乳腺癌淋巴结检测用试剂,特别是指乳腺癌淋巴结转移快速免疫组化检测试剂,本专利技术还涉及免疫组化检测方法,应用于早期乳腺癌淋巴结快速病理诊断。
技术介绍
乳腺癌淋巴结清扫是以往乳腺外科必不可少的治疗原则。近年来,随着乳腺疾病普查和诊断技术的进步,早期乳腺癌的发现率不断提高。因为早期乳腺癌的大部分并无腋窝淋巴结转移,若一律施行腋窝淋巴结清扫,无腋窝淋巴结转移的患者非但不能从中获益反而造成不必要的损害。因此,准确预测腋窝淋巴结转移的有无对为早期乳腺癌患者制定治疗方案极为重要。通过临床查体,影像学及肿瘤标志物等方法均不能准确预测早期乳腺癌患者腋窝淋巴结转移的有无,而前哨淋巴结(sentinel lymph node,SLN)检查可为这部分患者提供有益的帮助。前哨淋巴结是接受肿瘤淋巴引流的第一个淋巴结,通过检查乳腺癌SLN来推断腋窝淋巴结有无转移是以最小创伤来获取乳腺癌淋巴结转移资料最有效的方法,避免不必要的腋窝淋巴结清扫。SLN是Cabanes于1977年在睾丸癌研究中提出的,20世纪90年代初Giuliano等用于乳腺癌研究。通过十余年的探索,目前临床上对乳腺癌SLN的定位和检测技术日趋完善,大量的研究证实了其可行性和准确性。一些国家正在进行大规模的临床实验,如美国称为ACSOGZ0010的计划对T1或T2N0M0乳腺癌,SLN阴性患者不做腋窝淋巴结清扫,SLN阳性则进入Z0011试验或做腋窝淋巴结清扫。Z0011试验对SLN阳性患者随机做腋窝淋巴结清扫或不做。而命名为NSABP-32的研究计划则是将SLN阳性患者做腋窝淋巴结清扫,阴性患者随机做或不做,已经得出初步肯定结果。国内已有多家单位将SLN应用于临床。费用/效益分析结果显示,前哨淋巴结活检(sentinel lymph node biopsy,SLNB)提高了疗效,降低了费用;危险/效益分析结果显示,SLNB减少了手术并发症,保持了患者上肢功能,提高了生活质量。Beechey将SLNB称之为乳腺癌外科治疗中的一次革命。SLN的实际应用与研究大多局限于SLNB,由于目前还缺乏SLN病理学检测的统一标准,加上存在病理检测的灵敏度和准确度问题,检测SLNB的微转移灶相当困难,常规检测假阴性率高达20-30%。其原因主要有两点一是切片时没有切到微转移灶所在部位,二是微转移灶周围往往伴有窦内皮细胞和组织细胞增生,单纯形态学上难以判定。针对前者目前普遍建议做多组织平面检查,而对后者则建议作免疫组化染色。常用的免疫标记有上皮类标记抗体CK19、CK(AE1/AE3)、CK20、EMA、MUC1,另外,近年来克隆的人乳腺球蛋白以其对乳腺癌的高度敏感性和特异性得到了广泛关注。这些抗原或具有上皮细胞特性或具有乳腺癌特异性,在乳腺癌细胞表达而淋巴结固有细胞则无相关表达,因此被广泛用于淋巴结微小转移的诊断。由于肿瘤在发生发展以及转移过程中,会出现不同性质的分化,使得瘤细胞的免疫标记呈现多样性。在一张切片上针对某种抗体有的细胞出现阳性反应,而有的细胞则为阴性,所以肿瘤的免疫组化染色阳性结果的判断标准一般定为着色肿瘤细胞超过肿瘤细胞总数的5%-20%,显然,对于只有少数肿瘤转移灶或微转移灶甚至单个肿瘤细胞,这个判断标准极不适用,应用单一抗体容易出现漏诊。迄今为止,应用各种上皮细胞特性或乳腺癌特异性抗体检测SLNB标本的研究报告很多,所有的报告都证实了应用免疫组化染色可以提高检测的敏感度。Marchetti等在mRNA水平检测包括CEA、CK19、C-Met、hMAM(Mammaglobin)、MUC1、betal->GalNAc-T和p97在内的7种乳腺癌标志物在乳腺癌引流淋巴结中的表达,证实了各抗体之间表达差异及组织学未能检出的微转移灶的存在。目前还缺乏SLN病理学检测的金标准,加上所用的抗体及病理标本的不同,难以对这些报告的一致性和灵敏度做出恰当的比较和评价。多组织平面HE染色联合应用多种抗体进行免疫组化染色,是病理学上检测SLN有无转移最敏感的方法。对于多种抗体联合应用的免疫组化染色,传统上有如下两种方法,一是做连续切片,在不同的切片上滴加不同的抗体,该方法的最大缺点是每张切片只能反映一种抗原表达的信息,工作量庞大,信号强弱的差异、阳性标准、结果的对比分析等很难掌握;二是双重、多重免疫染色,既在同一张切片上按顺序完成一个抗体的免疫组化染色后再进行第二种,第三种染色,该方法的缺点是操作繁琐费时,一套染色至少需要数小时才能完成。SLN更有意义的临床应用在于术中快速冰冻活检,SLN的快速冰冻活检诊断要求主要有两点,一是准确定性判断转移的有无,二是快速(20分钟内)。显然,传统的免疫组化染色系统繁琐费时不适用术中快速诊断标本,目前,由于缺乏灵敏度高、特异性强、简便易行的病理检查手段,冰冻活检假阴性率高这一问题制约着SLN的临床应用。寻找敏感性和特异性均好,同时又简便快速的免疫组化染色试剂是SLN研究急需解决的重点问题之一。
技术实现思路
本方法的目的是克服了现有技术中的不足,提供了一种用于冰冻切片的免疫组化检测的试剂及操作简单易行的检测方法。利用该试剂,使染色过程变的简单快速,前哨淋巴结病理检测的灵敏度高,特异性强、简便、快速,能在15-20分钟内作出判断。为了解决上述技术问题,本专利技术是通过以下方法来实现的所述试剂通过辣根过氧化物酶(简称为HRP)或荧光色素标记抗体,制备抗体-HRP或抗体-荧光色素标记复合物,通过效价测定,混合标记抗体配置而成。所述抗体是指具有乳腺癌细胞表达而淋巴结组织固有细胞不表达的阳性检测抗体或具有转移癌周围增生窦内皮细胞、组织细胞和淋巴细胞表达而乳腺癌细胞不表达的阴性对照抗体。上述阳性检测抗体指细胞角蛋白(如CK19)、上皮标记(如EMA)、粘蛋白(如MUC1)、乳腺癌相关蛋白(mammaglobin)等。上述阴性对照抗体为淋巴管标记(如VEGFR-3)、血管标记(如CD31)、组织细胞标记(如CD68)、淋巴细胞标记(LCA)等。所述荧光色素可为异硫氰酸荧光黄-FITC、四甲基异硫氰酸罗丹明-tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC及四乙基罗丹明-rhodamine,RIB200的任意一种。所制成的抗体-HRP/荧光色素标记复合物有用抗CK19抗体-HRP/荧光色素、抗EMA抗体-HRP/荧光色素、抗MUC1抗体-HRP/荧光色素和抗mammaglobin抗体-HRP/荧光色素混合调制成阳性检测试剂;用抗VEGFR-3抗体-HRP/荧光色素、抗CD31抗体-HRP/荧光色素、抗CD68抗体-HRP/荧光色素和抗LCA抗体-HRP/荧光色素混合调制成阴性对照试剂。优选在辣根过氧化物酶(HRP)与抗体偶联体系中加入葡聚糖(dextoran)形成抗体-葡聚糖-HRP标记复合物。所述的效价测定主要指通过ELISA方法检测标记抗体的工作浓度,将各抗体混合,使混合物中的各种抗体的最终浓度为测定的工作浓度。所述乳腺癌手术中切除淋巴结为前哨淋巴结或腋窝淋巴结。本专利技术的另外一个目的在于提供一种应用上了述试剂的乳腺癌淋巴结转移快速免疫组化检测方法,包括以下步骤(1)切片制备(恒温冷冻切片法)本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种乳腺癌淋巴结转移快速免疫组化检测试剂,其特征在于:所述试剂通过HRP或荧光色素标记抗体,制备抗体-HRP或抗体-荧光色素标记复合物,通过效价测定,混合标记抗体配置而成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:苏晶石孙爱静田景琦
申请(专利权)人:孙爱静
类型:发明
国别省市:33[中国|浙江]

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