一种魏氏梭菌病及其致病菌型的检测试纸制造技术

一种用于检测魏氏梭菌的金胶试纸，它包括塑料底板、金标垫、加样膜、吸水纸以及反应膜，其中反应膜上具有检测带（Ｔ带）和质控带（Ｃ带），其特征在于，所述金标垫由玻璃纤维素膜构成，膜上包被胶体金标记的单克隆抗体１，反应膜由硝酸纤维膜构成，膜上检测带包被单克隆抗体２，质控带包被抗鼠ＩｇＧ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及了一种魏氏梭菌病及其致病菌型的金胶检测试纸，具体讲是一种能快速检测样品中魏氏梭菌α毒素及能鉴定魏氏梭菌病致病菌型的试纸，可应用于兽医临床、畜牧养殖、食品安全、公共卫生、水质监测及相关领域。
技术介绍
魏氏梭菌(Clostridi umWelchii)，又称产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)，广泛分布于自然界，属典型的条件致病菌，也是动物肠道正常菌群的成员之一。它能引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性坏疽以及人类食物中毒，是近年来我国家畜“猝死症”的主要病原菌之一，对畜牧养殖业和人类健康构成严重危害。魏氏梭菌能产生多种外毒素，其中α、β、ε和ι是主要的致死毒素。依据主要致死性毒素与其抗毒素的中和试验可将魏氏梭菌分为A、B、C、D和E 5个型。各型菌均能产生的α毒素是第一个被发现既有酶活性又有毒素特性的细菌蛋白，被认为是最基本、最重要的致病因子。目前，魏氏梭菌检测采用的技术方法有魏氏梭菌的分离鉴定、对流免疫电泳、PCR、复合PCR、M-PCR、DNA芯片、ELISA、IHA、SPA-ELISA以及Dot-ELISA等。其中，魏氏梭菌的分离鉴定和对流免疫电泳采用传统的生化鉴定、动物感染试验，其方法繁琐耗时、灵敏度低，与临床的快速和准确诊断要求相去甚远；而PCR、复合PCR、M-PCR、DNA芯片、ELISA等方法的样品处理过程复杂，需要在有设备条件的实验室进行，并要求有熟练掌握分子生物学实验操作技能的实验人员，且成本较高。IHA、SPA-ELISA及Dot-EL ISA仅用于检测抗魏氏梭菌毒素抗体，不能检测毒素，在魏氏梭菌病，特别是魏氏梭菌所引起的“猝死症”中，动物机体往往来不及产生相应的抗体就已经死亡。现有免疫学诊断基于多价抗魏氏梭菌抗血清中和反应检测，这种方法耗时、灵敏度低，无法鉴定到亚型。胶体金免疫层析技术作为一种快速临床诊断技术，其特点是单分检测，方便快捷，除商品试剂外无需任何仪器设备，几分钟即可肉眼观察结果，且保质期长。然而到目前为止，国内外尚无基于胶体金层析法的魏氏梭菌病诊断检测试纸，包括文献报道和专利技术专利。本专利技术能同时完成魏氏梭菌病的早期诊断和致病菌的亚型鉴定，可应用于农村养殖户、基层养殖场、兽医临床等现场。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够克服现有技术的不足，方便及时地检测魏氏梭菌病及其致病菌型的金胶检测试纸。本专利技术提供的魏氏梭菌病及其致病菌型的金胶检测试纸，其α、A、B、C、D及E条带的金标垫由玻璃纤维素膜组成，α、A、B、C、D及E条带的反应膜由硝酸纤维素膜构成，其上分别具有检测带(T带)和质控带(C带)。将加样膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在塑料底板上分别制成α、A、B、C、D及E共6条试纸条带，其中，α条带含抗魏氏梭菌α毒素单抗1和抗魏氏梭菌α毒素不同表位的单抗2，A条带含抗A型魏氏梭菌单抗1和抗A型魏氏梭菌不同表位的单抗2，B条带含抗B型魏氏梭菌单抗1和抗B型魏氏梭菌不同表位的单抗2，C条带含抗C型魏氏梭菌单抗1和抗C魏氏梭菌不同表位的单抗2，D条带含抗D型魏氏梭菌单抗1和抗D魏氏梭菌不同表位的单抗2，E条带含抗E型魏氏梭菌单抗1和抗E型魏氏梭菌不同表位的单抗2。各条带质控带包被抗鼠IgG。装配时可以为α条带单独使用，也可以将α条带同A条带、B条带、C条带、D条带、E条带任意一条带或几条带组合使用。本专利技术的魏氏梭菌病及其致病菌型的联检金胶试纸具有以下优点(1)在魏氏梭菌病，特别是魏氏梭菌所引起的“猝死症”中，动物机体往往来不及产生相应的抗体就已经死亡。而本专利技术是基于魏氏梭菌α毒素的检测，一旦魏氏梭菌产生异常就会分泌α毒素，从而能实现对魏氏梭菌病的早期诊断，对魏氏梭菌病的流行病学及临床都有重要意义；(2)在知道畜禽患病后，为了防止魏氏梭菌病进一步传染和进行流行病学研究，从而为该病的预防及临床诊断与治疗提供可靠的依据。需要知道魏氏梭菌病的致病菌型，而本专利技术即可满足这一要求；(3)准确灵敏，特异性好，结果受外因影响较少，免疫胶体金快速诊断方法并不因为其快速而牺牲了它的灵敏准确性。此外，由于胶体金标记蛋白质是一物理结合过程，结合牢固，很少引起蛋白质活性改变，所以试剂非常稳定，不受温度等外界因素影响，可应用于农村养殖户、基层养殖场、兽医临床等现场，实验结果也可长期保存；(4)在实地即可应用，不需要在有设备条件的实验室内进行，对操作人员要求不高，按说明书操作即可，并可随时检测待检样品。因为没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与，所以也不会污染环境，具有放射性同位素或酶标等检测方法所无法比拟的安全性； (5)迅速快捷，结果客观，肉眼易于判断，可在几分钟之内得出结果；成本低廉，样品不需要特殊处理，所需试剂和样本量少。四附图说明图1，魏氏梭菌病及其致病菌型检测试纸结构正面示意图。1吸水纸；2金标垫；3金标线(结合的单克隆抗体1为抗魏氏梭菌α毒素的单抗，也可以为抗A型魏氏梭菌单抗，也可以为抗B型魏氏梭菌单抗，也可以为抗C魏氏梭菌单抗，也可以为抗D魏氏梭菌单抗，也可以是抗E型魏氏梭菌单抗)；4检测带(结合的单克隆抗体2为抗魏氏梭菌α毒素不同表位的单抗，也可以为抗A型魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以为抗B型魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以为抗C魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以为抗D魏氏梭菌不同表位的单抗，也可以是抗E型魏氏梭菌不同表位的单抗)；5反应膜；6质控带(结合抗鼠IgG)；7加样膜。五具体实施例方式实施例(一)抗原的提取抗原魏氏梭菌α毒素的提取经过粗提和精提两个阶段。粗提将A型魏氏梭菌菌株接种于半固体疱肉培养基，37℃培养10h后，按0.5％接种于半固体疱肉培养基中，37℃培养6h，用EKS滤板除菌滤过，滤液为粗制α毒素。精提粗制α毒素(培养滤液)用70％饱和硫酸铵盐析30min，10000rpm离心15min后，弃上清；沉淀加等量生理盐水溶液悬浮，经20％饱和硫酸铵盐析30min，10000rpm离心15min，上清再经60％饱和硫酸铵盐析30min，10000rpm离心15min，弃上清；沉淀加适量生理盐水溶液悬浮，再加15％丙酮(-20℃)，于4℃搅拌2h，1000rpm离心20min，上清再加60％丙酮于4℃搅拌30min，10000rpm离心15min，弃上清；沉淀加适量生理盐水溶液悬浮，然后加35％丙酮于4℃搅拌2h，10000rpm离心15min，上清再加60％丙酮于4℃静置30min，10000rpm离心15min，沉淀加适量生理盐水溶液悬浮，然后用生理盐水溶液透析；透析好的样品过HW-55凝胶柱，用0.01molpH7.1的硼酸缓冲液(含0.03molCaCl2)平衡并洗脱，按每管5ml收集，再次离心，条件同上，最后将沉淀悬浮1ml的NaCI溶液中，-20℃保存备用。抗原A、B、C、D及E型魏氏梭菌菌体蛋白的提取过程为，无菌接种环刮取冻存的魏氏棱菌菌种，划线接种于固体培养基上，37℃厌氧条件下培养过夜。挑取单个菌落，接种于100ml厌氧肉汤培养基中。37℃200rpm振荡培养18小时后。将细菌培养物转移到无菌的离心管中。4℃以12000rpm离心20分钟。取沉淀用0.25MNaCI洗涤两次本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李红玉，晏磊，何丽娟，陈瑜，张波，支德娟，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：