本发明专利技术涉及检测针对蛋白Ｃ／活化蛋白Ｃ内皮受体（ＥＰＣＲ）的自身抗体的高水平存在的方法。本发明专利技术的特征在于它包括在体外检测和定量样品中的抗ＥＰＣＲ自身抗体。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过检测和体外定量在样品中检测高水平针对内皮蛋白C/活化蛋白C受体(EPCR)的自身抗体的方法。
技术介绍
自身免疫疾病自身免疫疾病的特征在于有免疫反应的存在，其中某些因素诱导针对宿主组织的免疫反应，并且有攻击这些组织的异常抗体(自身抗体)的产生。这些自身免疫疾病包括诸如抗磷脂综合征(APLS)、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、全身性自身免疫血管炎等等的疾病。APLS是以与抗磷脂抗体的存在有关的血管血栓形成(静脉、动脉或微血管)和孕期并发症(胎死、早产或多发性自发流产)为特征。这些抗体是异质的，并且识别多种磷脂组合、磷脂结合蛋白或二者。最常检测到的抗磷脂抗体亚型包括所谓的抗凝血狼疮抗体(ACL)、抗心磷脂抗体和抗糖蛋白Iβ2抗体。当前研究了不包括在经典实验室标准中的其它抗磷脂抗体。这类抗体靶向不同于心磷脂的如磷脂酰乙醇胺的磷脂或靶向诸如膜联蛋白V和蛋白S的磷脂结合蛋白。但是，人们却几乎不知抗磷脂抗体的存在与血管血栓形成及流产间相关的机制。血管疾病根据涉及的血管类型(动脉、静脉或微循环的小内径血管)，血管病存在三种主要类型。对于动脉血管疾病，管壁硬化会降低通过血管腔的血流，因而长期减少由受损血管供血区域的血供给。这种动脉粥样硬化损伤可遭受并发症，导致在动脉内形成血栓，完全堵塞动脉，因而完全阻塞血流。在这种情况下，导致组织梗死。这种现象最常见的实例为当血栓形成影响到冠状动脉时的心肌梗塞，或者，当受影响的血管为脑部动脉时的中风。对于静脉血管疾病，血栓形成使回心血流变得错综复杂。当血栓的静脉壁中的血栓碎片脱落时，碎片将会在血流中迁移，一直到达肺静脉循环回路中才滞留下来-产生急性肺衰竭(称为肺栓塞的情况)。微循环疾病继炎症和/或不同器官中微循环血管的血栓形成而出现，且表现为微循环损伤的器官衰竭。血管疾病在西方国家是发病率和死亡率的重要原因。特别是，来自于InstitutoNacional de Estadistica(INE)(西班牙国家统计研究所)的数据表明，2000年心血管疾病是西班牙的第一死亡原因(约占总死亡率的35.0％)。在最常见的心血管系统疾病中，心脏血管或动脉血栓疾病(主要是急性心肌梗塞)构成第一死亡原因。目前，许多分子危险因素已得到鉴定，它们是一些患者中出现血栓形成的原因。其中一个这样的危险因素为存在所谓的抗磷脂抗体。最初认为这些自身抗体靶向阴离子磷脂；但是，后来表明许多这些自身抗体靶向诸如糖蛋白Iβ2或凝血酶原的蛋白质和磷脂之间形成的复合物。最近，发现其它具有抗凝结功能的蛋白质也有参与，如蛋白C(PC)、蛋白S、血栓调节蛋白或膜联蛋白V-这样就解释了为什么自身抗体的存在倾向于血栓形成。产科并发症产科并发症基本上包括妊娠第10周后胎死、婴儿早产、妊娠第10周前自发性流产、宫内生长迟缓、子痫和先兆子痫。EPCR活化的蛋白C(APC)是主要的凝血级联调控蛋白之一。APC的酶原PC被与内皮细胞表面的血栓调节蛋白结合的凝血酶活化。与蛋白S(它的非酶辅因子)组合的APC通过蛋白水解活化的因子V和VIII发挥它的抗凝结作用。在静脉和/或动脉血栓形成的患者体内检测到血栓调节蛋白、PC和蛋白S的基因性缺陷和获得性缺陷。内皮PC/活化PC受体(EPCR)是在内皮细胞膜上表达的，具有特异性和高亲和性结合PC和APC的糖蛋白。为使EPCR具有功能，它必须与稳定其三维结构的磷脂分子结合。PC与EPCR的结合显著增强了内皮细胞表面的凝血酶-血栓调节蛋白复合体对它的活化。EPCR的任务是将PC聚集到内皮表面，并将其呈递给凝血酶-血栓调节蛋白复合体-从而利于PC的有效活化。在体内，EPCR诱导了内皮细胞表面PC活化指标近乎9倍的增加-结果造成90％循环水平的APC。此外，只有当APC结合到EPCR上时，它才可活化蛋白酶活化的受体-1，这产生“保护细胞”的细胞信号，并阻止调亡。EPCR主要由静脉和动脉内皮表达，尤其是由那些大和中内径的静脉和动脉内皮表达。另外，合胞体滋养层也大量表达EPCR。在这些地方，EPCR阻止血栓形成和促进内皮和合胞体滋养层良好的细胞功能。愈来愈多的有力证据表明EPCR参与妊娠维持，因为，在基因敲除小鼠中，EPCR基因缺失引起这些小鼠的胎盘血栓和早期胚胎死亡。专利技术概述本专利技术涉及在来自个体的样品中测定抗EPCR自身抗体(IgG，IgA和IgM)的方法。另一方面，已证实这些自身抗体存在于经诊断为自身免疫疾病(APLS和播散性红斑狼疮)的患者、存在于血管疾病(静脉和动脉血栓形成)的患者和产科并发症女性患者体内。除了其它方面之外，伴随本说明书的实施例还阐明了以下事实在自身免疫疾病的患者(在APLS或播散性红斑狼疮患者中确定)中，在患有诸如动脉血栓形成，如心肌梗塞(在APLS和非APLS患者中确定)的血管疾病、或局部缺血性中风(在APLS患者中确定)或静脉血栓形成(在APLS患者中确定)的患者中，以及患有诸如胎死(在患有APLS和未患有APLS的女性中确定)或多次流产(在APLS患者中确定)的产科并发症的患者中，在血清或血浆中抗EPCR自身抗体的水平会增加。本专利技术的创作者发现，自身免疫疾病患者、和/或血管疾病患者和/或产科并发症患者的血清或血浆中抗EPCR自身抗体的水平，与不受这些疾病的影响的健康个体的样品相比有增加。这些证据使得所述抗EPCR自身抗体成为有用的标记物，用于在体外评估个体出现与存在增加水平的针对EPCR的自身抗体相关疾病的危险度和素因，这些疾病例如为自身免疫疾病、血管疾病或产科并发症。对APLS患者体内抗EPCR自身抗体的存在及其与胎死的关系作了研究。也评估了这些自身抗体对内皮表面APC生成的影响。然后，在配对病例-对照研究中研究了抗EPCR自身抗体与胎死的关联性。得到的结果支持了抗EPCR自身抗体构成胎死了的危险因素这一观点。阻止PC在表达EPCR的细胞表面的活化可能是这些自身抗体发挥它们的病理作用的一种机制。附图简述附图说明图1显示rhsEPCR在Pichia pastoris中的表达。rhsEPCR从稳定转化的P.pastoris细胞上清中纯化出，如材料与方法部分所述(见实施例)。将含有rhsEPCR的3组分每种10μl进行SDS-PAGE分离，使用GELCODE Blue检测蛋白(A)或采用单克隆的抗myc抗体(Invitrogen)进行Western印迹检测蛋白(B)。图2比较在诊断为APLS的患者及对照者体内的抗EPCR自身抗体水平。显示了抗EPCR自身抗体的水平。IgM同种型抗体对照(中值＝45AU，任意单位)，患者(中值＝57AU)；IgA同种型抗体对照(中值＝31AU)，患者(中值＝39AU)；和IgG同种型抗体对照(中值＝72AU)，患者(中值＝75AU)。图3显示抗EPCR自身抗体对内皮细胞生成APC的影响，其中在患者C中可观察到在同种型M抗EPCR自身抗体存在时的APC的生成，并与抗体不存在时和非抑制性抗体存在时APC的生成比较。每种情况都进行了2-4次独立的实验。专利技术详述定义为方便理解本专利技术申请，下面对本专利技术上下文中使用的一些术语和表述的含义进行解释。术语“个体”指哺乳动物物种的成员，并且包括但不限于家养宠物、灵长类和人类；个体优选是任何年龄或本文档来自技高网...
【技术保护点】
评估样品中的针对内皮ＰＣ／活化ＰＣ受体（ＥＰＣＲ）的自身抗体的高水平存在的方法，其特征在于包括在体外定量来自个体的所述样品中的针对ＥＰＣＲ的自身抗体。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：何塞埃米达桑托斯，拉蒙蒙特斯迪亚斯，韦罗妮卡乌尔塔多利纳雷斯，
申请(专利权)人：西玛生物医学信息公司，
类型：发明
国别省市：ES[]
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