锌指蛋白HZF1抗体制造技术

本发明专利技术涉及一种生物蛋白特异性多克隆抗体和单克隆抗体、它们的制备方法及其应用。更具体地，本发明专利技术涉及锌指蛋白ＨＺＦ１的特异性多克隆抗体和单克隆抗体、它们的制备方法及其在与ＨＺＦ１功能相关疾病诊断中的应用。该抗体可应用于与ＨＺＦ１功能和红系细胞和巨核细胞分化相关的肿瘤、贫血及红系细胞或（和）巨核细胞减少症的诊断以及与ＨＺＦ１功能和其他细胞和组织分化发育相关疾病的诊断中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物蛋白的特异性抗体、其制备方法及其应用。更具体地，本专利技术涉及锌指蛋白HZF1的特异性多克隆和单克隆抗体、它们的制备方法及其在与HZF1功能相关疾病诊断中的应用。该抗体可应用于与HZF1功能和红系细胞分化和巨核细胞分化异常相关的肿瘤、贫血和细胞减少症的诊断以及与HZF1表达和功能和其他细胞和组织分化发育相关疾病的诊断中。
技术介绍
真核生物有机体的发育涉及生长及按照准确时空的细胞和组织分化。分化了的细胞形态和功能特异性是由特定基因的表达决定的。作为维持生命重要生理过程的造血涉及骨髓多能造血干细胞向具有不同形态及功能的血细胞的分化和发育成熟。虽然已提出不同的造血机制模型，但人们相信干细胞向某类细胞链系的分化决定和进一步分化发育成熟可能涉及许多基因的表达，由这些基因表达形成的调节网络最终决定了细胞的特异形态及功能。不正常的造血细胞分化可能导致严重的血液系统疾病，如在血液系统肿瘤中的分化阻抑或逆分化以及由于干/祖细胞增殖或分化异常导致的再生障碍性贫血。与造血细胞分化有关的重要基因及调节网络的确定对揭示细胞分化机制具有重要的理论意义，并可能对某些与造血相关的血液性疾病(如血液系统肿瘤、贫血和细胞较少症等)的防治产生实际意义。本专利技术涉及一种生物蛋白特异性抗体、它的制备方法及其应用，更具体地，本专利技术涉及一种编码锌指蛋白(HZF1)的特异性抗体、它的制备方法及其在与HZF1功能相关疾病诊断中的应用。该抗体可应用于包括针对与HZF1功能和造血细胞分化及肿瘤相关疾病的诊断以及与HZF1功能和其他细胞和组织分化发育和肿瘤相关疾病的诊断中。比本申请稍早提交的另一份专利申请中(专利技术名称为“锌指蛋白HZF1基因的功能及其应用”，申请号为200510109116X)，专利技术人对锌指蛋白HZF1的表达和功能做了深入的研究。利用细胞转染和报告基因技术证明HZF1蛋白定位于细胞核。这与从蛋白结构推断HZF1可能作为一个转录因子在基因转录调节中发挥作用相一致。用Northern杂交分析证明HZF1mRNA在广泛的组织和多种血液细胞系中有不同程度的表达，说明其可能在多种细胞和组织中行使功能。HZF1mRNA在处于红系和巨核系共同祖细胞阶段的红白血病K562细胞中表达很低，但随着hemin诱导的红系分化及PMA诱导的巨核系分化表达上调，暗示HZF1可能在红系分化和巨核细胞分化中发挥作用。应用反义核酸和RNA干扰技术，发现内源HZF1表达的抑制严重阻遏K562细胞向红系和巨核系两个方向的分化，证明了HZF1在红系和巨核系分化和发育中的重要作用。造血细胞分化发育的异常通常与某些疾病密切相关，如血液系统肿瘤(白血病)细胞的分化阻遏或逆向分化，再生障碍性贫血中的干/祖细胞分化阻遏等。影响HZF1功能和表达的因素有可能导致上述疾病，因此HZF1有可能成为控制和治疗某些白血病和再生障碍性贫血的靶基因。许多锌指蛋白，特别是C2H2型锌指蛋白已被证明影响多种组织和细胞的分化和发育，我们已证明HZF1在造血组织以外的其他组织表达，因此HZF1也可能在其他组织细胞的分化发育中具有重要作用。上述内容在此引入作为参考。专利技术详述本专利技术涉及一种编码锌指蛋白(HZF1)的特异性多克隆抗体和单克隆抗体、它们的制备方法及其在与HZF1功能相关疾病诊断中的应用。因此，本专利技术提供了一种利用HZF1抗体作为检测细胞和组织中HZF1表达水平的手段。进一步地，本专利技术提供了一种与HZF1功能及红系分化和巨核细胞分化相关的肿瘤、贫血和红细胞或(和)巨核细胞减少症的诊断手段。本专利技术还提供了一种与HZF1功能相关的其他疾病的诊断手段。本专利技术中的术语“抗体”涉及所有可能类型的抗体，特别涉及多克隆和单克隆抗体，还涉及通过化学、生物化学或基因技术方法产生的抗体。制备这样的分子的方法对于本领域技术人员是公知的。然而在抗体制备过程中，抗原的选择起了关键的作用。现有技术中已经鉴别了多个C2H2型锌指蛋白基因，近来从对基因组顺序的分析预测人类基因组包含700多个编码C2H2型锌指蛋白的基因(Nature409860-921，2001)。由于这些蛋白的锌指区氨基酸顺序高度保守，从而使得制备针对某一锌指蛋白的高特异性抗体具有较高难度。我们通过与GenBank中的顺序进行BLAST同源性比较，搜寻HZF1中低同源性顺序作为抗原。优选地使用非锌指部分序列作为抗原。把相应于这些氨基酸顺序的DNA顺序插入pET30a载体，感染大肠杆菌，获得了稳定的能诱导表达HZF1融合蛋白的克隆，进而制备和纯化了融合蛋白，免疫兔，最终获得针对HZF1蛋白的高效的和高特异性抗体。并进一步利用杂交瘤技术获得了针对HZF1蛋白的高效的和高特异性单克隆抗体。附表(SEQUENCE LISTING)说明附表列出了构建的表达HZF1融合蛋白的重组质粒pET30aHZF1中的表达序列及相应氨基酸序列。从第142到720核苷酸为插入pET30a载体的HZF1cDNA中编码HZF1非锌指区的顺序(相应于融合蛋白中的第48到240氨基酸)。其余为原载体中的表达顺序。表达和纯化的这一融合蛋白被用作免疫抗原。附图说明图1表明得到了优化表达HZF1融合蛋白的BL21菌株，HZF1融合蛋白可在大肠杆菌中诱导表达。图中M代表蛋白marker，泳道1和3为IPTG诱导4h的菌裂解物，泳道2和4为未经IPTG诱导的菌裂解物。图2表明使用BL21表达HZF1的菌株可诱导表达HZF1融合蛋白，采用Novagen公司的Ni柱可以很好地纯化HZF1蛋白，得到的蛋白纯度高。图中泳道1为通过Ni柱结合HZF1融合蛋白后的流出液，泳道2和3为使用Ni柱纯化后的HZF1融合蛋白。图3显示了兔免疫血清的ELISA分析结果，表明由于用HZF1融合蛋白接种，兔产生了对其的强的免疫应答，而在免疫前的血清中没有发现对HZF1的免疫应答。图4显示用Western blot方法，证明抗HZF1抗体没有和表达HZF1融合蛋白的菌株中的其它蛋白产生免疫应答，而只和HZF1融合蛋白发生免疫应答。图中泳道1为没有诱导的转化菌(pET30a-HZF1)，泳道2为IPTG诱导4h的转化菌(pET30a-HZF1)。图5显示用HZF1抗体和Western blot方法，证明在经过hemin诱导或PMA诱导48h的人红白血病细胞K562(已知其表达高水平的HZF1mRNA)中检测到高水平HZF1蛋白，而在未诱导的K562细胞中(已知其表达很低水平的HZF1mRNA)未能检测到HZF1蛋白。说明抗HZF1抗体可以很好地识别和结合细胞和组织中表达的HZF1蛋白。图6显示了单克隆抗体的ELISA分析结果，说明获得了高滴度的单克隆抗体。图7显示用HZF1单克隆抗体和Western blot方法证明，在经过hemin诱导48h的人红白血病细胞K562(已知其表达高水平的HZF1mRNA)中检测到高水平HZF1蛋白，而在未诱导的K562细胞中(已知其表达很低水平的HZF1mRNA)未能检测到HZF1蛋白。说明获得的单克隆抗体特异地与HZF1蛋白结合而不与其它蛋白发生结合，能用于组织和细胞中HZF1蛋白的特异检测。图8显示了K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i稳定转染子用HZF1本文档来自技高网...

【技术保护点】
锌指蛋白ＨＺＦ１高效性和特异性抗体的制备方法。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊武，彭瀚，杜占文，张昕，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[]