一种用于活性导向筛选抗AIDS天然产物的方法技术

本发明专利技术涉及ＨＩＶ－１逆转录酶抑制剂的筛选方法，依据ＨＩＶ－１逆转录酶以单一碱基ＲＮＡ为模板催化ＤＮＡ合成，利用ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ和ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ随机掺入ＤＮＡ中，形成ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ双标记的ＤＮＡ；再通过抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体特异性捕获ＤＮＡ，利用荧光标记链亲和素与ｂｉｏｔｉｎ标记ＤＮＡ的特异性结合进行检测，根据荧光强弱可知合成ＤＮＡ中生物素的量，从而推算ＨＩＶ－１逆转录酶的活性。本发明专利技术克服了以往方法中生物素干扰造成假阳性的难题，对天然产物中的ＨＩＶ－１逆转录酶抑制活性进行高效、灵敏检测，方法简便，抗干扰能力强，在抗ＡＩＤＳ天然产物的筛选中具有广泛应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种HIV-1逆转录酶抑制剂的筛选方法，具体说是其在天然产物粗提物中活性导向发现抗AIDS化合物方面的应用。
技术介绍
HIV-1逆转录酶(HIV-1 RT)抑制剂是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的潜在治疗药物，目前AIDS治疗药物的大部分是逆转录酶抑制剂。逆转录酶具有突出的靶点特异性，是当前AIDS治疗药物的研究热点，发现新型、高效的HIV-1逆转录酶抑制剂极具应用价值。天然产物中蕴含种类繁多、结构新颖的化合物，是新药的重要来源之一。目前对于天然产物的活性筛选大多集中于分离后获得的纯化合物的筛选，在这些纯化合物中发现真正高活性物质的几率很低，这是由于分离提取工作的盲目性导致的。活性导向分离提取有助于解决这个问题，提高工作效率。虽然HIV-1逆转录酶抑制剂抑制活性检测方法检测手段多样，但局限于纯化合物的逆转录酶抑制活性检测。由于天然产物粗提物中含有大量内源性生物素的干扰，因此目前用于HIV-1逆转录酶抑制剂抑制活性检测的方法无法用于粗提物的筛选，个别方法尽管影响较小，但由于操作复杂难以广泛使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单、可对粗提物进行HIV-1逆转录酶抑制活性跟踪筛选抗AIDS天然产物的方法。方法原理HIV-1逆转录酶以RNA为模板催化DNA合成，在反应过程中生物素标记dUTP(biotin-dUTP)和digoxigenin标记dUTP(DIG-dUTP)随机掺入DNA。HIV-1逆转录酶活性通过单位时间内掺入的biotin-dUTP体现，活性越高，单位时间内掺入的biotin-dUTP越多。合成的DNA通过掺入的DIG-dUTP捕获到已包被抗digoxigenin抗体(anti-DIG)的孔板上。加入过量的BHHCT-Eu3+标记链亲和素SA(BSA)0.9(BHHCT-Eu3+)46溶液后，标记链亲和素和biotin-dUTP特异性结合，以时间分辨荧光模式测定结合的SA(BSA)0.9(BHHCT-Eu3+)46的荧光强度，得到HIV-1逆转录酶的活性。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种用于活性导向筛选抗AIDS天然产物的方法，以HIV-1逆转录酶抑制活性的检测来对天然产物粗提物进行活性筛选；具体为，将天然产物粗提物加入到HIV-1逆转录酶催化的以单一碱基组成的RNA为模板的DNA合成反应中，biotin标记dUTP和digoxigenin标记dUTP随机掺入DNA，形成digoxigenin-biotin双标记的DNA；再通过digoxigenin标记DNA与抗digoxigenin抗体的特异性结合进行捕获，通过biotin标记DNA与荧光标记链亲和素的特异性结合进行检测，根据荧光强弱可知合成DNA中生物素的量，从而推算HIV-1逆转录酶的活性。HIV-1逆转录酶活性直接影响DNA的合成进而体现在单位时间内掺入的biotin-dUTP，最终以荧光强度检测得到，HIV-1逆转录酶活性越高，单位时间内掺入的biotin-dUTP越多。本专利技术克服了以往方法中生物素干扰造成假阳性的难题。具体操作过程为1)将anti-DIG稀释在PBS缓冲液中，配制终浓度为8～16mg/l的包被液；在96孔板中每孔加入60～100μ1包被液，包被18～36小时；2)用Tris-HCl缓冲液洗板，每孔用60～100μl 1～2％BSA封闭液封闭30～60分钟；然后再用Tris-HCl缓冲液洗板；3)配制反应混合物0.5～1.0A260nm/ml模板/引物，0.1～10μM底物，0.1～10μM biotin-dUTP，0.1～10μM DIG-dUTP，45～50mM Tris，200～300mMKCl，20～30mM MgCl2，8～12mM DTT；4)将HIV-1RT稀释在裂解缓冲液中，裂解缓冲液组成为45～50mMTris-HCl，pH 7～8，80～100mM KCl，1～5mM DTT，0.5～1.0mM EDTA，0.5～1.0％(v/v) Triton X-100，配制终浓度为50～100mU/μl HIV-1 RT溶液；5)将一定量的天然产物粗提物溶解在裂解缓冲液中；6)将20～40μl反应混合物、20～40μl天然产物粗提物溶液和20～40μlHIV-1 RT溶液加入到聚合酶链式反应管(PCR tube)内，在PCR仪上37℃逆转录反应20分钟以上；7)将PCR tube中的混合物移入到包被、封闭好的板孔中，保鲜膜封板37℃孵育30～60分钟；用Tris-HCl缓冲液洗板；8)每孔加入稀释的BHHCT-Eu3+标记链亲和素SA(BSA)0.9(BHHCT-Eu3+)46溶液60～100μl，保鲜膜封板37℃孵育1～2小时，其中链亲和素浓度1～10μg/ml；用Tris-HCl缓冲液洗板，在时间分辨荧光免疫分析仪上检测；以时间分辨荧光模式测定结合的SA(BSA)0.9(BHHCT-Eu3+)46的荧光强度，得到HIV-1逆转录酶的活性。步骤6)以20～40μl反应混合物、20～40μl裂解缓冲液进行逆转录反应，作为背景信号；以20～40μl反应混合物、20～40μl裂解缓冲液和20～40μl HIV-1 RT溶液，作为阳性对照。抑制率计算 本专利技术与现有技术相比具有如下优点1.本专利技术方法灵敏度、准确度与精密度高，抗生物素干扰能力强。2.应用范围宽。本专利技术由于有效避免了内源性生物素带来的干扰，可以用于天然产物粗提物的活性导向筛选，检测粗提物的HIV-1 RT抑制活性，进而指导提取分离工作；可以准确定量实际样品的HIV-1 RT活性，例如AIDS患者的血清；可以筛选纯化合物的HIV-1 RT抑制活性，并确定其半数抑制浓度；由于使用了微量滴定板，配合自动化操作仪器和数据处理系统，即可用于高通量筛选。3.简便省时。本专利技术操作步骤仅包括包被、封闭、逆转录反应、捕获、标记物特异性结合和检测，后四步仅需要约2.8小时，目前现有技术方法均超过4小时。4.应用方便。可根据本专利技术检测方法开发出相应的检测试剂和试剂盒，其应用将十分方便快捷。总之，本专利技术方法可对天然产物粗提物中的HIV-1逆转录酶抑制活性进行高效、灵敏检测，方法简便，抗干扰能力强，在抗AIDS天然产物的筛选和发现中具有广泛应用前景。附图说明图1为不同HIV-1 RT浓度与背景扣除的荧光强度的关系曲线图；注荧光计数(Fluorescence Counts)图2为生物素对本专利技术方法在检测已知抑制剂抑制HIV-1 RT活性时的干扰图谱；图3为掺入生物素对已知抑制剂抑制率的影响图谱；图4为本专利技术方法检测繁茂膜海绵粗提物中添加已知抑制剂的效果图谱；图5为相同量的Efavirenz在空白和添加入繁茂膜海绵粗提物中的抑制率图谱。具体实施例方式下面通过具体实施例对本专利技术的方法与结果进行说明，本专利技术使用铕荧光标记物BHHCT-Eu3+标记链亲和素进行荧光定量测定，其中BHHCT-Eu3+是带有生物标记功能的有机配位体与3价铕离子形成的荧光化合物，荧光测定方法包括常规的荧光测定法与时间分辨荧光测定法；其中BHHCT-Eu3+采用申请人已申报的专利制备(申请号03133857.7，专利技术名称β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针及其制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于活性导向筛选抗ＡＩＤＳ天然产物的方法，其特征在于：以ＨＩＶ－１逆转录酶抑制剂抑制活性的检测来对天然产物粗提物进行筛选；具体为，在逆转录反应体系中加入天然产物粗提物，逆转录反应体系包括ＨＩＶ－１逆转录酶、单一碱基组成的ＲＮＡ及引物、ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ、ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ，ＨＩＶ－１逆转录酶以单一碱基组成的ＲＮＡ为模板催化ＤＮＡ合成，ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ和ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ随机掺入ＤＮＡ，形成ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ双标记的ＤＮＡ；再通过ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记ＤＮＡ与抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体的特异性结合进行捕获，通过ｂｉｏｔｉｎ标记ＤＮＡ与荧光标记链亲和素的特异性结合进行检测，ＨＩＶ－１逆转录酶活性通过单位时间内掺入的ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ体现，活性越高，单位时间内掺入的ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ越多。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张卫，袁景利，胡政，靳艳，王桂兰，虞星炬，金美芳，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]