根据本发明专利技术，证明了在阿尔茨海默病的转基因模型中，ＡＰＰ中经选择的突变例如Ａｓｐ－＞Ａｌａ（Ｄ６６４Ａ）突变（其防止在胱天蛋白酶切割位点处进行切割）防止海马突触丢失和齿状回萎缩，虽然这些突变不干扰Ａβ的生成或淀粉样斑块的形成。因此，鉴于这些发现，开发出了用于鉴定阻断在ＡＰＰ的Ａｓｐ６６４处的切割的药剂的方法，包括用于这种目的的转基因动物，以及应用它们治疗神经变性疾病的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及阿尔茨海默病的非人转基因模型及其应用，包括鉴定可用于治疗阿尔茨海默病的化合物的方法、应用这样的化合物进行治疗的方法和类似方法。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是最常见的痴呆症，其特征是老年斑(senile plaques)、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles)和脑中突触和神经元的丢失。老年斑的主要蛋白成分是β-淀粉样肽(Aβ)，它是通过其前体β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein)(APP)的蛋白水解切割而产生的。淀粉样蛋白假说指出，Aβ启动了造成AD的级联事件。淀粉样蛋白毒性的精确机制尚不清楚，但是已经积累了突触是Aβ损害的早期易受攻击位点的证据(参见，例如，Selkoe，D.J.，Science 298789-91(2002))。与此观点一致的是，脑中具有高水平Aβ的一些APP转基因小鼠在老年斑形成之前表现出突触丢失、行为改变和突触传递减弱(参见，Hsia，A.Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 963228-33(1999)和Mucke et al.，J.Neurosci.204050-8(2000))。近来，已表明，APP也在Asp664(APP695编号)处被胱天蛋白酶(caspase)切割，胱天蛋白酶是介导凋亡的半胱氨酸蛋白酶(参见Gervais，F.G.et al.Cell 97395-406(1999)和Lu，D.C.et al.Nat Med 6397-404(2000))。这样的加工过程释放出细胞毒性的羧基端肽APP-C31；然而，还不清楚胱天蛋白酶对APP的加工在AD中可能起到的作用(如果有的话)。在通过胱天蛋白酶进行细胞质内切割之后产生细胞毒性肽的这种情形，与已经被说明的依赖性受体诸如DCC(在结肠直肠癌中被缺失)、RET(在转染期间被重排)和UNC5H1-3(不协调基因5同源物1-3)中发生的情形相似，这表明，APP可能作为依赖性受体而发挥功能(Bredesen et al，Physiological Reviews，press 2004)。因此，使得能够研究蛋白酶例如胱天蛋白酶在此类神经变性疾病如阿尔茨海默病的发展中所起的作用的转基因模型的开发，将具有重要意义。此外，获得这样的转基因模型，将有助于对神经变性疾病的新的治疗的开发。专利技术概述 根据本专利技术，证明了在阿尔茨海默病的转基因模型中，所选择的突变诸如APP中的Asp->Ala(D664A)突变(其防止在胱天蛋白酶切割位点处进行切割)既防止海马突触丢失又防止齿状回萎缩，虽然这些突变不干扰Aβ的生成或淀粉样斑块的形成。因此，鉴于这些发现，开发出了用于鉴定阻断在APP的Asp664处的切割的药剂的方法，包括可用于此种目的的转基因动物，以及应用它们来治疗神经变性疾病的方法。在神经变性疾病如阿尔茨海默病的发展中进行早期干预，将有助于突触功能的恢复，并减少神经元网络的丢失，神经元网络的丢失是神经变性疾病的晚期阶段的特点。附图说明 图1均涉及PDAPP和PDAPP(D664A)转基因小鼠的表征。图1A图示了在制备PDAPP和PDAPP(D664A)转基因小鼠中应用的构建物的引出(derivation)。图1B图示了在各种实验动物中对可溶性Aβ的检测。图1C总结了不同实验动物中Aβ斑块的数目。图1D图示了16月龄PDAPP(D664A)小鼠的经染色的脑切片，显示出Aβ斑块的存在。图1E图示了在体内对APP在Asp664处进行的切割。使用对由在Asp664处对APP进行切割而产生的新表位具有特异性的抗体证明，与对照小鼠和PDAPP(D664A)小鼠相比，在PDAPP中的切割增加。图2均说明D664A突变对突触丢失和齿状回萎缩的影响。图2A总结了多种实验动物中突触前密度的定量。图2B总结了海马总体积和其亚区域的体积，正如应用Imaris3D(BitplaneAG， Switzerland)三维重建所确定(参见图2C)和经卡瓦列里分析(Cavalieri analysis)所证实。图2C显示了代表性PDAPP(红色)和B21(黄色)转基因小鼠的齿状回分子层的3D表而重建的正交面、矢状面和冠状面视图。图3均说明D664A突变对基础突触传递的影响。图3A示出了几个细胞外记录的场EPSPs，应用它们来评价3-7月龄杂合Tg和非Tg PDAPPJ20和PDAPP(D664A)B21小鼠的海马CA3和CA1细胞之间的基础突触传递强度。正如所述，非转基因小鼠和转基因小鼠在增加的刺激强度下的代表性场EPSPs被显示出来。注意在PDAPPJ20 Tg小鼠中，引发相对小的EPSP需要大的输入(参见带有放大的时间标度的插图箭头指示出纤维群峰，它是被活化的轴突数目的间接度量)。图3B示出了Tg和非Tg动物的EPSP起始斜率除以纤维群峰的幅度(数据针对非Tg同窝动物进行标准化)，正如所述。每个数据点代表了获自6-7只小鼠的17-22张切片的平均结果。统计学分析(ANOVA)表明了显著的群组效应(p＜0.0005)。Post-hoc Tukey检验证实，PDAPPJ20小鼠具有比所有其它组显著低的基础突触传递(p＜0.01)，而在其它组中彼此之间并没有显著不同。图3C示出了双脉冲易化(paired-pulse facilitation)，其被表示为一对刺激诱发的fEPSPs的平均幅度的比值。数据在图中表示为均值+/-SEM。图4均说明了D664A突变对PDAPP诱导的海马神经发生增强的影响。图4A示出了对海马齿状回的颗粒下区中的增生细胞的BrdU标记。对十二个月对照(非-Tg)、PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠腹膜内给予BrdU，持续3天，一周后处死。通过免疫组织化学方法检测被BrdU标记的细胞(黑点)。显示的图像代表4-6个动物/组。图4B说明了BrdU标记的定量。显示的数据是平均细胞数目±SD(n＝4-6)；用学生t检验(Student′s t test)评价差异的显著性。图5提供了通过卡瓦列里分析和三维重建得到的体积之间的关联。专利技术详述 根据本专利技术，提供了非人转基因动物，其包含编码突变人β-淀粉样前体蛋白(APP)或APP样蛋白的核苷酸序列，其中所述突变人APP或APP样蛋白包括导致该突变人APP或APP样蛋白对在Asp664处的切割具有抵抗性的突变，并且其中编码该突变人APP或APP样蛋白的核苷酸序列被可操纵地连接到合适的启动子。在本专利技术的一个方面，在Asp664处的切割是受蛋白酶诱导的。在本专利技术的目前的一个优选方面，在Asp664处的切割是受胱天蛋白酶诱导的。在本专利技术的一个方面，突变人APP或APP样蛋白包括在残基664处的突变。本领域技术人员知道，事实上除天然Asp之外的在位点664处的任何残基都会降低蛋白酶如胱天蛋白酶在位点664处切割APP或APP样蛋白的能力。目前优选的位点664处的突变包括将天然Asp转变为Ala、Glu、Gln或者类似氨基酸。在本专利技术的另一方面，突变人APP或APP样蛋白包括与残基664相邻的一个或多个突变，从而降低蛋白酶如胱天蛋白酶在位点6本文档来自技高网...
【技术保护点】
非人转基因动物，其包含编码突变型人β淀粉样前体蛋白（ＡＰＰ）或ＡＰＰ样蛋白的核苷酸序列，其中所述突变型人ＡＰＰ或ＡＰＰ样蛋白包括使得所述突变型人ＡＰＰ或ＡＰＰ样蛋白对Ａｓｐ６６４处的切割具有抵抗性的突变，并且其中编码所述突变体ＡＰＰ或ＡＰＰ样蛋白的所述核苷酸序列可操纵地与适当的启动子连接。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：DE布雷德森，V加尔万，
申请(专利权)人：巴克研究所，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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