检测HBB基因突变的引物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了检测β地中海贫血相关的HBB基因突变的方法、引物和试剂盒，所述引物、试剂盒均包括针对HBB基因全外显子的扩增引物和测序引物。基于PCR扩增和Sanger测序，本发明专利技术可快速地检测β地中海贫血相关的HBB基因突变位点的突变情况。

【技术实现步骤摘要】
检测HBB基因突变的引物、方法和试剂盒
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测β地中海贫血相关的HBB基因突变的方法、引物和试剂盒。
技术介绍
β地中海贫血(CAH)是一组由肾上腺皮质激素合成过程中酶的缺陷所引起的常染色体隐性遗传性疾病。根据酶缺乏成都CAH可以分为失盐型CAH、单纯男性化型CAH、非典型性CAH，前两者统称为典型CAH。该病的发病率较低，新生儿CAH的发病率约为1/16000～1/20000，典型的CAH发病率约为1/10000，非典型CAH的发病率约为典型的10倍，且女性多于男性。而21羟化酶缺陷症(21OHD)是其中最常见的类型，约占90％～95％，21OHD在新生儿中的发病率约为1/15000～1/18000。人体中编码21羟化酶的基因HBB定位于6p21.3的HLAⅢ区域，具有10个外显子和9个内含子，该基因与不具有活性的假基因(CYP21P)串联排列在C4A和C4B基因的3’端，两者相距30Kb，而且外显子和内含子的同源性分别为98％和95％。这种高度的同源性造成检测HBB突变较为困难，因此通过qPCR技术，无法应用于复杂重排的检测，难以广泛开展。其他的诸如Southern杂交技术、等位基因特异性聚合酶链反应、等位基因特异性寡核苷酸探针、RFLP等都存在繁琐、耗时耗力或无法检测所有突变类型等，都无法使用这些方法检测基因HBB的突变。所以目前最好的方法就是对HBB基因进行直接测序，可以快速准确诊断出患者的病情。目前该病在中国人群的常见的突变是IVS2-13A/C>G、R356W、I172N和E3Δ8bp等。
技术实现思路
本专利技术采用Sanger测序法检测β地中海贫血相关的HBB基因突变，并且设计的引物分别扩增包含基因HBB全外显子上的DNA片段，通过测序结果的分析，可以很直观地了解β地中海贫血相关的HBB基因突变位点的突变情况，扩增引物设计时加上了M13接头，并使用M13作为测序引物，简化操作步骤和节约了检测成本。本专利技术提供了检测HBB基因突变的引物，其特征在于，包括至少一对用于扩增HBB基因的扩增引物和一对测序引物M13F和M13R，所述扩增引物选自自HBB-1_2F/HBB-1_2R，HBB-3_6F/HBB-3_6R，HBB-7_9F/HBB-7_9R，HBB-10F/HBB-10R；，其碱基序列为：HBB-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；HBB-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；HBB-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-7_9R：ACCAGCCTCCACCACATTTAACAGCTATGACCATG；HBB-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG；M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：AACAGCTATGACCATG。进一步地，所述突变选自IVS2-13A/C>G、R356W、I172N和E3Δ8bp等中国人常见突变。本专利技术还提供了一种检测检测样品中HBB基因突变的方法，其包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物，所述至少一对扩增引物选自HBB-1_2F/HBB-1_2R，HBB-3_6F/HBB-3_6R，HBB-7_9F/HBB-7_9R，HBB-10F/HBB-10R；(3)利用测序引物M13F与M13R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与野生型HBB基因序列进行比较，确定HBB基因是否发生突变；其中所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：HBB-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；HBB-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；HBB-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-7_9R：ACCAGCCTCCACCACATTTAACAGCTATGACCATG；HBB-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG；M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：AACAGCTATGACCATG。本专利技术还提供了一种检测样品中HBB基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括扩增体系PCR反应液和测序体系反应液，其中扩增体系PCR反应液包括至少一对扩增引物，测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R，所述至少一对扩增引物选自HBB-1_2F/HBB-1_2R，HBB-3_6F/HBB-3_6R，HBB-7_9F/HBB-7_9R，HBB-10F/HBB-10R；，所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：HBB-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；HBB-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；HBB-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-7_9R：ACCAGCCTCCACCACATTTAACAGCTATGACCATG；HBB-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGTHBB-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG；M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：AACAGCTATGACCATG。进一步地，所述扩增体系PCR反应液还包括2×PCRBuffer、dNTPs和KODFXDNA聚合酶。进一步地，所述测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测HBB基因突变的引物，其特征在于，包括至少一对用于扩增HBB基因的扩增引物和一对测序引物M13F和M13R，所述扩增引物选自HBB-1_2F/HBB-1_2R、HBB-3_6F/HBB-3_6R、HBB-7_9F/HBB-7_9R、HBB-10F/HBB-10R，其碱基序列为：/nHBB-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGT/nHBB-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；/nHBB-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT/nHBB-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；/nHBB-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACGGCCAGT/nHBB-7_9R：ACCAGCCTCCACCACATTTAACAGCTATGACCATG；/nHBB-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGT/nHBB-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG；/nM13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；/nM13R：AACAGCTATGACCATG。/n...

【技术特征摘要】
1.检测HBB基因突变的引物，其特征在于，包括至少一对用于扩增HBB基因的扩增引物和一对测序引物M13F和M13R，所述扩增引物选自HBB-1_2F/HBB-1_2R、HBB-3_6F/HBB-3_6R、HBB-7_9F/HBB-7_9R、HBB-10F/HBB-10R，其碱基序列为：
HBB-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGT
HBB-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；
HBB-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT
HBB-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；
HBB-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACGGCCAGT
HBB-7_9R：ACCAGCCTCCACCACATTTAACAGCTATGACCATG；
HBB-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGT
HBB-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。


2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述突变选自IVS2-13A/C>G、R356W、I172N和E3Δ8bp突变。


3.一种检测样品中HBB基因突变的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物，其中，所述扩增引物选自HBB-1_2F/HBB-1_2R，HBB-3_6F/HBB-3_6R，HBB-7_9F/HBB-7_9R，HBB-10F/HBB-10R；
(3)利用测序引物M13F与M13R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型HBB基因序列进行比较，确定HBB基因是否发生突变；
所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：
HBB-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGT
HBB-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；
HBB-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT
HBB-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；
HBB-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACG...

【专利技术属性】
技术研发人员：柏忠良，
申请(专利权)人：南京艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32