本发明专利技术公开一种提高蒙古黄芪的病程相关蛋白的可溶性表达量的重组表达载体，所述重组表达载体以pET30a为载体，利用大肠杆菌分子伴侣skp修饰AmPR‑10构建的重组子pET30a‑skp‑AmPR‑10。本发明专利技术通过更换载体和分子伴侣修饰的方法提高目的蛋白的可溶性表达量，进而实现节约成本，提高产量的目的，并进一步对外源表达的AmPR‑10进行了活性测定，表明外源表达的蛋白同样具有核酸酶活性，且为其他同源相关蛋白的体外表达提供可参考策略，且该活性可能对于研究黄芪抗RNA类病毒的能力具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种提高蒙古黄芪的病程相关蛋白的可溶性表达量的重组表达载体
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种提高蒙古黄芪的病程相关蛋白的可溶性表达量的重组表达载体。
技术介绍
植物病程相关蛋白(pathogenesis-relatedproteins,PR)是植物体在被病原体侵害及受到外界压力时产生的，对植物自身的抗病免疫性能有重要意义。其主要被划分为14个家族，包括PR-1至PR-14。研究表明，其中病程相关蛋白PR-10不仅仅参与植物的抗病机制反应，同时在植物的自身发育中也起作用(WalterMH,LiuJW,WunnJ,etal.Beanribonuclease-likethnesrelatedproteingenes(YPR-10)displaycomplexpatternsofdevelopmental,dark-inducedandexogenousstimulus-dependentexpion[J].EurJBiochem,1996,239:281-293)。近年来，蒙古黄芪的病程相关蛋白AmPR-10也开始受到关注，有研究证明天然的AmPR-10成熟蛋白由158个氨基酸组成，理论大小为16.8KDa，且具有核酸酶活性(齐笑玮,蒙古黄芪中两种生物活性蛋白的研究[D],中国农业大学,2006；任晋宏，薛慧清，刘晔，蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10纯化及生物学功能研究，中国中药杂志，2018,43：3662-3666)。并有文献指出，PR-10类蛋白的核酸酶活性可能在植物防御病原体感染中起作用，和其抗RNA类病毒相关(温韵洁,何卫红,黄群声.病程相关蛋白10在植物防御反应中的作用，植物生理学通讯)。因此体外研究AmPR-10的性能对进一步探讨黄芪生长发育及抗病机制具有重要意义，然而从天然黄芪中提取蛋白的传统方法成本较高，蛋白得率较少，后续研究不便。
技术实现思路
专利技术目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出了种提高蒙古黄芪的病程相关蛋白的可溶性表达量的重组表达载体，可以有效提高目的蛋白的可溶性表达量，进而实现节约成本，提高产量的目的。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术通过以pET30a为载体，利用大肠杆菌分子伴侣skp修饰AmPR-10构建的重组子pET30a-skp-AmPR-10，意外地发现其可以有效地提高目的蛋白的可溶性表达量。具体构建方法包括如下步骤：(1)以蒙古黄芪总RNA为模板，通过RT-PCR得到目的基因AmPR-10，其由158个氨基酸组成，其核苷酸序列如SEQNO.1所示；具体地，先取黄芪叶片，剪碎，称重，根据重量计算需要的Trizol试剂体积进行研磨成匀浆状，再用氯仿抽提，离心分离最终RNA溶于水相。然后以RNA为模板，进行PCR得到。(2)以大肠杆菌k12基因组为模板，通过PCR得到大肠杆菌分子伴侣skp，其由161个氨基酸组成，其核苷酸序列如SEQNO.2所示(包含终止子taa)；本步骤可通过细菌基因组提取试剂盒来完成的，提取K12的基因组，然后通过PCR进行skp的扩增。(3)利用大肠杆菌表达载体pET-30a克隆目的基因，先将skp与载体pET30a相连，然后再将AmPR-10连接在skp的下游，构建重组子pET30a-skp-AmPR-10。具体流程如图1所示。本专利技术进一步提出了上述重组表达载体在提高蒙古黄芪的病程相关蛋白AmPR-10的可溶性表达量上的应用。具体地，将重组子pET30a-skp-AmPR-10于LB液体培养基中培养，至菌体浓度OD600达到0.5-0.6时加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导，分别于37℃培养4小时诱导蛋白表达，然后通过超声破碎获得目标蛋白的粗蛋白液，将粗蛋白液溶于Tris-HCl缓冲液中，最后通过Ni2+蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白。具体地，异丙基硫代半乳糖苷IPTG终浓度达0.1mM。有益效果：本专利技术以AmPR-10基因为研究对象，首次建立其在大肠杆菌体内的可溶性表达体系，并通过更换载体和分子伴侣修饰的方法提高目的蛋白的可溶性表达量，进而实现节约成本，提高产量的目的，并进一步对外源表达的AmPR-10进行了活性测定，不仅证明了外源表达的蛋白同样具有核酸酶活性，而且为其他同源相关蛋白的体外表达提供可参考策略，且该活性可能对于研究黄芪抗RNA类病毒的能力具有重要意义。附图说明图1重组子pET30a-skp-AmPR-10的构建流程图；图2为基因AmPR-10和skp的条带扩增结果；图3为重组子鉴定结果，其中，(A)重组子pET28a-AmPR-10鉴定结果；(B)重组子pET30a-AmPR-10鉴定结果；图4为重组子pET30a-skp-AmPR-10鉴定结果；图5为重组子pET28a-AmPR10于37℃蛋白表达及纯化情况；图6为重组子pET30a-AmPR10于37℃蛋白表达及纯化情况；图7为重组子pET30a-skp-AmPR10于37℃蛋白表达及纯化情况；图8为目标蛋白核酸酶活性检测结果；图9为S-tag修饰前后39位Val、40位Thr空间构象角色变化；图10为S-tag修饰前后91位Asp、92位Ala、93位Asn空间构象角色变化；图11(A)为AmPR-10三级结构预测模拟图，(B)为skp与AmPR-10融合表达三级结构预测模拟图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术名做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本专利技术，但是本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。本专利技术以AmPR-10基因为研究对象，建立其在大肠杆菌体内的可溶性表达体系，并通过更换载体和分子伴侣修饰的方法提高目的蛋白的可溶性表达量。菌种材料：蒙古黄芪叶片(山西中医药大学种植)；大肠杆菌K12购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；感受态E.coliBL21购于生工生物工程(上海)有限公司。工具酶及载体：PCR聚合酶、限制性内切酶NcoI、EcoRI、Xhol、T4DNA快速连接酶购于生工生物工程(上海)有限公司；克隆表达载体pET-28a，pET-30a由山西中医药大学基础医学院实验中心提供。试剂盒及相关试剂：细菌基因组提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、PCRCleanup试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶纯化试剂盒、Ni2+纯化蛋白试剂盒、酵母tRNA等均购于生工生物工程(上海)有限公司。实施例1重组子构建。(1)蒙古黄芪总RNA提取：称取蒙古黄芪叶片0.2g，在冰上研磨至匀浆，转移至离心管。加入1mlTrizol试剂室温放置5min。加入氯仿和异丙醇离心抽提，室温晾干加入缓冲液溶解RNA。(2)目的基因克隆：以蒙古黄芪总RNA为模板，通过RT-PCR试剂盒，得到AmPR-10的PCR产物，其由158个氨基酸构成，蛋白大小16.8kD；提取大肠杆菌K12基因组，以其为模板，得到大本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高蒙古黄芪的病程相关蛋白的可溶性表达量的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pET30a为载体，利用大肠杆菌分子伴侣skp修饰AmPR-10构建的重组子pET30a-skp-AmPR-10。/n
【技术特征摘要】
1.一种提高蒙古黄芪的病程相关蛋白的可溶性表达量的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pET30a为载体，利用大肠杆菌分子伴侣skp修饰AmPR-10构建的重组子pET30a-skp-AmPR-10。
2.权利要求1所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以蒙古黄芪总RNA为模板，通过RT-PCR得到目的基因AmPR-10，其由158个氨基酸组成，其核苷酸序列如SEQNO.1所示；
（2）以大肠杆菌k12基因组为模板，通过PCR得到大肠杆菌分子伴侣skp，其由161个氨基酸组成，其核苷酸序列如SEQNO.2所示；
（3）利用大肠杆菌表达载体pET-30a克隆目的基因，构建...
【专利技术属性】
技术研发人员：王珏，
申请(专利权)人：山西中医药大学，
类型：发明
国别省市：山西;14
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