调控真菌木质纤维素降解酶系表达的元件及其应用制造技术

本发明专利技术公开了调控真菌木质纤维素降解酶系表达的元件及其应用。本发明专利技术首次发现转录因子HIKLF12在特异腐质霉木质纤维素降解酶系表达过程中具有重要的全局调控作用，

【技术实现步骤摘要】
调控真菌木质纤维素降解酶系表达的元件及其应用
本专利技术涉及转录因子HIKLF12的新用途，尤其涉及转录因子HIKLF12在调控真菌木质纤维素降解酶系表达中的用途，属于转录因子HIKLF12的新用途领域。
技术介绍
生物质是地球上储量最为丰富的可再生资源，利用廉价的生物质材料生产液体燃料和大宗化工用品，可以有效地缓解能源和环境危机，促进全球经济的可持续发展(Banerjee,G.,Scott-Craig,J.,andWalton,J.(2010).ImprovingEnzymesforBiomassConversion:ABasicResearchPerspective.BioEnergyResearch3,82-92)。生物质主要由通过木质素结合在一起的纤维素和半纤维素组成，其中含量最高的纤维素是由葡萄糖以β-1，4-糖苷键链聚化形成的聚合物，其内部结构复杂，具有水不溶性的结晶区，难以降解利用。化学水解法和酶水解法是可将纤维素转化为葡萄糖的两种方法。使用无机酸在苛刻条件下对纤维素进行化学水解的产物中不仅包含可发酵的糖，而且还包含对后续发酵步骤中使用的微生物有毒的糖降解产物，例如糠醛。通常需要附加的解毒步骤从水解产物中去除副产物中的抑制剂（JuturuV,JinCW(2012)Microbialxylanases:Engineering,productionandindustrialapplicationsBiotechnologyAdvances30:1219-1227）。利用微生物产生的纤维素酶分解纤维素因具有条件温和、环境友好以及副产物污染少等优点而更具吸引力，受到世界各国的广泛关注和深入研究（SoniSK,SharmaA,SoniR(2018)Cellulases:RoleinLignocellulosicBiomassUtilizationMethodsinmolecularbiology(Clifton,NJ)1796:3-23doi:10.1007/978-1-4939-7877-9_1）。丝状真菌具有丰富的木质纤维素酶系，且胞外蛋白的分泌水平相比其他微生物具有很大的优势，所以目前用于工业化生产的纤维素酶大多来自于真菌，其中里氏木霉是目前应用最广泛的纤维素酶系生产菌株(Lynd,L.R.,Weimer,P.J.,vanZyl,W.H.,andPretorius,I.S.(2002).Microbialcelluloseutilization:fundamentalsandbiotechnology.Microbiologyandmolecularbiologyreviews:MMBR66,506-577.)。但木霉存在着酶系中β-葡萄糖苷酶酶活低、半纤维素酶种类少，酶蛋白热稳定性不佳、最适pH偏酸性等问题，这极大地限制木霉产纤维素酶类的应用（邹根,刘睿,魏勇军,周志华,严兴(2014).木质纤维素酶基因资源挖掘及真菌酶系改造.生物加工过程,63-71.)。因此，研究开发木霉之外的优良木质纤维素酶生产菌株，具有重要的理论意义与应用价值。嗜热真菌特异腐质霉（Humicolainsolens）因其强大的纤维素利用能力和完善的纤维素降解酶表达分泌能力，在生物质能源、饲料、酿酒和纺织等领域重要重要的应用价值。特异腐质霉可以产生丰富的纤维素、半纤维素酶类，并且具有生长温度高、生长快、分泌能力强、所产酶耐高温偏中性等优点（Xu,X.,Li,J.,Zhang,W.,Huang,H.,Shi,P.,Luo,H.,Liu,B.,Zhang,Y.,Zhang,Z.,Fan,Y.,etal.(2015).ANeutralThermostablebeta-1,4-GlucanasefromHumicolainsolensY1withPotentialforApplicationsinVariousIndustries.PloSone10,e0124925.）。近年，在国际上特异腐质霉因其在生物质能源开发、酿造工业、纺织工业及高效外源基因表达等领域的巨大应用前景而受到人们的广泛重视。但目前特异腐质霉原始菌株的纤维素酶产量仍较低，无法满足工业生产的需求。深入了解、研究其中纤维素酶的表达调控机制，并以此为依据，对生产菌株进行定向遗传改良，是提高纤维素酶的工业生产水平、降低工业生产成本的重要途径。HIKLF12在人和小鼠中的同源蛋白编码了Krueppel-likefactor12，参与了生长发育调控过程（RothC,SchuiererM,GuntherK,BuettnerR(Jul2000)."GenomicstructureandDNAbindingpropertiesofthehumanzincfingertranscriptionalrepressorAP-2rep(KLF12)".Genomics.63(3):384–90），但未见其参与真菌木质纤维素降解酶系表达调控的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供转录因子HIKLF12在调控真菌木质纤维素降解酶系表达中的用途；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术首次发现转录因子HIKLF12在特异腐质霉木质纤维素降解酶系表达过程中具有重要的全局调控作用，将Hiklf12基因在特异腐质霉进行高表达可明显提高特异腐质霉中多种纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的表达量：本专利技术首先克隆特异腐质霉Hiklf12基因的完整开放阅读框，利用特异腐质霉翻译延伸因子1基因的组成型强启动子Ptef1和色氨酸合酶基因的终止子，构建Hiklf12基因表达框；将该Hiklf12表达框克隆至M13-PTgpd-neo载体，构建得到Hiklf12基因高表达质粒M13-PTgpd-neo-Hiklf12；将Hiklf12高表达质粒通过原生质体转化转入特异腐质霉构建得到高表达菌株，命名为Hiklf12OE。RT-qPCR鉴定高表达菌株中Hiklf12基因的转录水平较野生型菌株，结果显示，Hiklf12基因的转录水平在高表达菌株中显著高于野生型菌株。为了鉴定Hiklf12高表达对特异腐质霉纤维素酶表达水平的影响，本专利技术将Hiklf12高表达菌株和野生型菌株进行纤维素诱导条件下的摇瓶发酵。结果发现，Hiklf12高表达菌株发酵上清中的滤纸酶活力、木聚糖酶活力和漆酶活力较野生型菌株显著升高，qRT-PCR结果显示，多种纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶基因的转录水平显著提高，这表明，HIKLF12在特异腐质霉木质纤维素降解酶系的表达过程中，具有重要的全局性调控作用。由此，本专利技术提供了转录因子HIKLF12在调控真菌木质纤维素降解酶系表达中的用途。其中，所述的真菌优选是特异腐质霉（Humicolainsolens）。进一步，本专利技术提供了一种提高特异腐质霉中多种纤维素酶、半纤维素酶或木质素降解酶的表达量的方法，包括：将Hiklf12基因在特异腐质霉中进行高表达或过表达；譬如：将Hiklf12基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在真菌中表达该本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.转录因子HIKLF12在调控真菌木质纤维素降解酶系表达中的用途。/n

【技术特征摘要】
1.转录因子HIKLF12在调控真菌木质纤维素降解酶系表达中的用途。


2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的调控真菌木质纤维素降解酶系表达是将转录因子HIKLF12编码基因在真菌中高表达提高纤维素酶、半纤维素酶或木质素降解酶的表达量。


3.按照权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的真菌是特异腐质霉（Humicolainsolens）。


4.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，将Hiklf12基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在真菌中表达该基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转化真菌，使Hiklf12基因在真菌中进行高表达或过表达。


5.按照权利要求4所述的用途，其特征在于，所述重组表达载体由5′端非编码区，Hi...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐欣欣，张伟，刘波，张宇宏，范超，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11