circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用制造技术

本发明专利技术公开了circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用。本发明专利技术采用具有较低的免疫原性、较高的多向分化潜能且易于取材，一次取材获取细胞量大的羊膜间充质干细胞，实验表明在hAMSC‑CM刺激后HUVEC中circ6148表达增高，HUVEC迁移，成管能力均增加，细胞内circ6148表达降低可以抑制hAMSC‑CM导致的血管生成作用。在HUVEC中导入circ6148重组质粒可模拟hAMSC‑CM介导的HUVEC迁移，成管能力增加，促进血管生成效果更优。另外，通过重组质粒技术获得促进血管生长的重组质粒，获得方法简单，且稳定性好，弥补了hAMSC获取困难，有效成分易分解等缺点，在促进HUVEC成血管中有着重要作用，为拓展干细胞疗法奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用
本专利技术属于血管生成研究领域，具体涉及circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用。
技术介绍
血管生成在生长发育、器官和组织再生以及许多生理病理条件下都发挥着重要作用。致密的血管系统为高度合成代谢的组织细胞提供氧气和营养并运输代谢废物。血管新生过程中，需要氧气和营养的组织会分泌促血管生成分子，触发内皮细胞延伸出丝状伪足，称之为尖端细胞。这些尖端细胞引导萌芽，并将它们的丝状足向血管生成信号的来源延伸，随后细胞增殖以完成血管出芽。最终，尖端细胞与相邻芽中的尖端细胞相连，建立新的导管环路。由此看来，由生长因子介导的血管内皮细胞增殖在血管新生中十分重要。干细胞由于其具有自我更新和多向分化潜能，近年来被用于细胞和组织再生。由于干细胞获取困难，目前干细胞疗法多采用异体细胞，由于其来源及排异反应，安全性有待评估，且干细胞产量较低。干细胞疗法作为近十年来再生医学的热点，在促进成血管方面也取得了很大进展。干细胞是指机体具有自我更新和直接分化成其他细胞的双重能力的细胞。天然的干细胞种类有:胚胎多能或全能干细胞和成人干细胞。成人干细胞主要包括骨髓(骨髓多能干细胞)、内皮祖细胞(EPC)、各种组织细胞(组织多能干细胞)和血液循环干细胞等。间充质细胞(MSCs)具有多潜能、免疫应答和旁分泌等特性，可分化为多种细胞系，具有促进血管生成的潜能，有望成为再生医学的候选细胞。羊膜间充质干细胞(hAMSC)是娩后废弃的胎盘中获得的干细胞，其具有较低的免疫原性、较高的多向分化潜能及无伦理学限制等优点，且易于取材，一次取材获取细胞量大。近年来，使用间充质干细胞条件培养基(CM)代替细胞共培养研究间充质干细胞对研究细胞的单项作用的排除细胞互作干扰。已有研究显示间充质基质细胞条件培养基有促进血管生成的作用。而条件培养基(CM)组分复杂，性质不稳定，易分解，故而我们希望找出在羊膜间充质干细胞促进血管内皮细胞成血管过程中发挥关键作用的生物分子，能大部分代替羊膜间充质干细胞的促血管生成作用。环状RNA(circularRNA，circRNA)是一种共价闭合环状单链RNA，无poly尾巴，由pre-mRNA通过反向剪切行成，性质稳定可以抵抗RNaseR降解，是近几年研究兴起的一种新型非编码RNA。其具有独特的通过共价键结合的环状封闭结构，无5’末端帽子结构及3’末端poly(A)尾巴。随着第二代测序的发展成熟以及生物信息学的快速发展，越来越多的circRNA被发现，并且有越来越多文章表明，如circHIPK3可作为RNA海绵吸附miR-558抑制膀胱癌血管新生有研究表明，circRNA可以通过多种机制促进成血管，但大多数集中于肿瘤成血管研究。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供circ6148(hsa-circ0006148)及其重组载体在促进血管生成上的应用，本专利技术以刺激血管内皮细胞前后的羊膜间充质干细胞条件培养基进行外泌体芯片分析，根据表达值筛选合适的circRNA。并在血管内皮细胞中验证，再利用由大肠杆菌内获取的circ6148重组质粒代替hAMSC的促成血管作用，该应用有效提高了血管生成的效率。另外，circ6148及其重组质粒的获取方法简单，操作简便，弥补了hAMSC获取困难、有效成分易分解等缺点，在促进HUVEC成血管中有着重要作用。为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：circ6148在促进血管生成上的应用，所述circ6148的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。一种重组质粒，所述重组质粒整合了权利要求1中所述的circ6148核苷酸序列。一种重组载体，转化权利要求2中所述的重组质粒。上述的重组载体在制备预防或治疗与血管生成相关疾病的产品中应用。一种促进血管生成的药物组合物，所述药物组合物的有效成分为上述的circ6148或重组载体。上述药物组合物在制备预防或治疗与血管生成相关疾病的产品中应用。进一步改进的是，所述与血管生成相关的疾病为肿瘤、眼科疾病、脑部退行性病变，缺血性心血管疾病、伤口愈合及组织损伤修复或组织工程技术。进一步改进的是，所述眼科疾病为糖尿病视网膜病变或老年黄斑变性；所述脑部退行性病变为帕金森、多发性硬化症、脊髓损伤或中风。有益效果：与现有技术相比，本专利技术circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用，通过发现在干细胞促进血管生成作用中的关键分子，并探究其变化对干细胞介导的血管生成的影响，为拓展干细胞疗法奠定基础。具有如下优势：1、本专利技术采用具有较低的免疫原性、较高的多向分化潜能且易于取材，一次取材获取细胞量大的羊膜间充质干细胞(hAMSC)，以刺激血管内皮细胞前后的羊膜间充质干细胞条件培养基进行外泌体芯片分析，根据表达值筛选合适的circ6148，并在血管内皮细胞中验证，circ6148确实具有促进血管生成的功效，且HUVEC迁移，成管能力均增加。因此，新分子circ6148属于首次被发现在血管生成上具有促进作用，且从其他母源基因转路形成的，未有报道指出其母源基因SAMD8与成血管相关，来源广泛；2、本专利技术通过设计特异性circ6148引物，利用PCR技术扩增出circ6148，并通过一代测序的方法测定circ6148的准确的环化位点，再利用由大肠杆菌内获取的circ6148重组质粒，在细胞内过表达circ6148比hAMSC-CM有更好的促进HUVEC迁移及血管生成的作用。在HUVEC中导入circ6148重组质粒可模拟hAMSC-CM介导的HUVEC迁移，成管能力增加，且细胞内circ6148表达降低可以抑制hAMSC-CM导致的血管生成作用。更重要的是，重组质粒获得简便，稳定性好。重组质粒技术已十分成熟但利用circRNA重组质粒替代hAMSC的促血管生成作用鲜少应用。本专利技术利用由大肠杆菌内获取的circ6148重组质粒代替hAMSC的促成血管该应用有效提高了血管生成的效率，之前未出现在任何研究报道中。附图说明图1为外泌体芯片的热图；图2为外泌体芯片的散点图；图3为hAMSC-CM刺激后HUVEC胞内circ6148表达值变化的Q-PCR检测结果；图4为在HUVEC内转染circ6148重组质粒的转染效率的Q-PCR检测结果；图5为hAMSC-CM刺激及转染circ6148重组质粒及小干扰RNA后检测HUVEC细胞迁移率的TRANSWELL实验，(a-g)为HUVEC在小室中培养12小时后结晶紫染色的40倍物镜图，(h)为数据统计结果；图6为hAMSC-CM刺激及转染circ6148重组质粒及小干扰RNA后检测HUVEC成管能力的成管实验，(a-g)为HUVEC在matrigel培养6小时后的40倍物镜图，(h)为数据统计结果。具体实施方式以下各个实施例所用的材料都是常规商业化的材料，引物均购于上海生工生物工程有限公司。实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.circ6148在促进血管生成上的应用，其特征在于，所述circ6148的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.circ6148在促进血管生成上的应用，其特征在于，所述circ6148的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒整合了权利要求1中所述的circ6148核苷酸序列。


3.一种重组载体，其特征在于，转化权利要求2中所述的重组质粒。


4.基于权利要求3所述的重组载体在促进血管生成上的应用。


5.一种促进血管生成的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分为权利要求1所述的cir...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈铭，肖轶婧，陆史俊，袁小琴，孙典，刘金明，
申请(专利权)人：南京医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32