一种重组SPAM1蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组SPAM1蛋白及其应用，属于医学技术领域。所述重组SPAM1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术的重组SPAM1蛋白具有较高的降解透明质酸的酶活力。与不含有GPI修饰结构域SPAM1‑W相比，加入含有GPI锚修饰结构域的SPAM1重组蛋白后，精子胞内钙信号明显提高且其顶体反应发生率显著增加。完整SPAM1蛋白的成功制备将更有效的提高体外受精作用，提高其临床应用度，为男性不育的治疗提供有效的手段。

【技术实现步骤摘要】
一种重组SPAM1蛋白及其应用
本专利技术属于医学
，具体涉及一种重组SPAM1蛋白及其应用。
技术介绍
特异性人精子黏附分子（SPAM1）是通过羧基末端的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定至精子头部浆膜和顶体内膜，但不跨越膜磷脂双层的单链膜蛋白，即人透明质酸酶PH-20。SPAM1的509个氨基酸序列主要由三部分组成：信号肽（1-35氨基酸）、SPAM1结构区（36-483氨基酸）及GPI锚修饰结构域（484-509氨基酸）。GPI修饰锚是真核生物翻译后修饰所产生，主要由磷酸氨基乙醇联结子、核心聚糖和糖脂链组成，其中在聚糖核心的磷酸肌醇、葡萄糖胺甘露醇残基可以被磷酸氨基乙醇组和其他糖类不同程度的修饰，这种复杂的结构具有编码细胞膜表面上不同功能的能力。GPI锚定蛋白SPAM1的生理功能具有多样性，如：发挥位于头部浆膜透明质酸酶中性活性和顶体内膜酶酸性、中性活性，有效降解卵细胞周质；识别并结合透明带，促进精卵结合；作为透明质酸受体，调节Ca2+信号而介导精子顶体胞吐作用。近年来，针对SPAM1的特异酶活性，科研人员将检测SPAM1的透明质酸酶活性的高低作为预测人类精子受精潜能的重要指标。虽然研究表明无GPI锚修饰结构区的重组SPAM1已被成功体外表达并应用于体外受精（IVF）和胞浆内单精子注射（ICSI）技术，也可用于解决大分子药物难以渗透肿瘤细胞外基质的问题中，但该重组蛋白缺乏因GPI结合肽段（484-509氨基酸区域），限制了SPAM1进行更好的临床应用。现有研究表明不育男性精子SPAM1活性与精子密度、活力、形态及精卵结合等因素密切相关，精子顶体内透明质酸含量及活性的降低是导致男性不育的重要原因之一，检测透明质酸活性可作为临床评价精子功能的有效指标。因此，完整的SPAM1蛋白的成功制备将有助于深入理解受精过程，并为男性不育的诊断与治疗提供新策略。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组SPAM1蛋白，该重组SPAM1蛋白含有GPI修饰结构域，具有较高的降解透明质酸的酶活力，可用于治疗弱精症。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种重组SPAM1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；编码所述重组SPAM1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。上述重组SPAM1蛋白的制备方法，包括以下步骤：步骤1，利用HindIII/XhoI双酶切位点将SEQIDNO:2所示序列插入至表达载体pcDNA3.1(+)中，获得C端含有His标签的重组质粒；步骤2，将重组质粒转染至293T细胞进行表达，并对获得的蛋白进行纯化，得到重组SPAM1蛋白。上述重组SPAM1蛋白在制备男性不育治疗药物中的应用。上述重组SPAM1蛋白在制备男性不育诊断药物/试剂中的应用。本专利技术通过体外重组并优化纯化条件获得含有GPI修饰结构域的SPAM1蛋白，该重组蛋白具有较高的降解透明质酸的酶活力。与不含有GPI修饰结构域SPAM1-W相比，加入含有GPI锚修饰结构域的SPAM1重组蛋白后，精子胞内钙信号明显提高且其顶体反应发生率显著增加。完整SPAM1蛋白的成功制备将更有效的提高体外受精作用，提高其临床应用度，为男性不育的治疗提供有效的手段。附图说明图1为实施例1中SPAM1重组蛋白的纯化结果，（a）为AKTA纯化系统分析阴离子交换层析曲线，(b)为SDS-PAGE检测结果。图2为实施例1中SPAM1重组蛋白降解透明质酸活力的标准曲线。图3为实施例2中重组蛋白SPAM1对人精子细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i）的影响。图4为实施例3中重组蛋白SPAM1对人精子顶体反应的影响结果。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。实施例1GPI锚定SPAM1蛋白体外重组及纯化利用HindIII/XhoI双酶切位点将全基因合成的SPAM1/SPAM1-W的目的基因插入至表达载体pcDNA3.1(+)中，获得C端含有His标签的重组质粒Spam1-pcDNA3.1(+)和Spam1-W-pcDNA3.1(+)，转染至细胞密度高达80%-90%的293T细胞中，37℃、5%CO2培养箱中培养24-48h，收集细胞。利用试剂盒分离细胞膜蛋白与浆蛋白，16000rpm离心30min，抗SPAM1抗体进行westernblot检测。上述重组SPAM1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述重组SPAM1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。SPAM1-W蛋白为缺乏GPI结合结构域的SPAM1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，编码所述重组SPAM1-W蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。采用NiSepharoseExcel柱进行亲和层析，并SDS-PAGE检测纯度，根据纯度和杂蛋白情况再借助离子交换柱进行进一步优化纯化制备条件，检测蛋白纯度。如图1所示，所制得的SPAM1重组蛋白电泳条带清晰，纯度高。利用将SPAM1重组蛋白按一定比例进行稀释置于96孔板中，加入适量温热的透明质酸底物，震荡后37℃，反应10min，血清工作液加入上述反应液中，震荡混匀15min后测量样品在640nm处的吸收度并计算重组蛋白活性。如图2所示，利用浊度法测定纯化的重组蛋白SPAM1及SPAM1-W体外降解透明质酸底物的比活力分别为420.21±1.19U/mg和340.43±0.25U/mg。实施例2高通量测定精子胞内钙信号5μM荧光探针Fluo-4AM和0.05%表面活性剂PluronicF-127加入percoll纯化的精子中，37℃、5%CO2培养箱中避光染色30min。2000rpm离心5min，弃上清，HS缓冲液重悬，重复两次，即获得荧光染色的精子溶液。人精子Ca2+浓度的变化通过FlexStation3全自动钙流检测工作站进行检测：以HS缓冲液为阴性对照、孕酮P4为阳性对照，20μL不同浓度的SPAM1或SPAM1-W蛋白分别自动加入至80μL荧光染色后的精子中，490nm激发波长/525nm发射波长检测精子胞内Ca2+离子变化情况。如图3所示，含有GPI锚定重组蛋白SPAM1对人精子[Ca2+]i产生高达80%的增强效应，而缺乏GPI结合结构域的SPAM1-W则对[Ca2+]i无影响，进一步说明了GPI锚修饰结构域对人精子胞内钙信号转导起关键调节作用。实施例3金霉素染色法（CTC）考察SPAM1对人精子顶体反应的作用取1mL液化好的精液进行percoll梯度纯化，适量HTF重悬沉淀。取50μL重悬精子混悬液，加入阳性对照孕酮P4、阴性对照HTF缓冲液及重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组SPAM1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组SPAM1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.根据权利要求1所述的重组SPAM1蛋白，其特征在于：编码所述重组SPAM1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.权利要求1所述重组SPAM1蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，利用HindIII/XhoI双酶切位点将SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾亚云，曾旭辉，陈晨，彭利忠，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32