用于制备4-雄甾烯-3,17-二酮（4-AD）的HGMS2菌株突变体制造技术

本申请提供了用于制备4‑雄甾烯‑3,17‑二酮(4‑AD)的HGMS2菌株突变体。HGMS2菌株突变体的KstD和Ksh基因被敲除。本申请的敲除KstD和Ksh基因的HGMS2菌株与野生型HGMS2菌株相比，敲除型菌株显著降低了ADD和9‑OH‑AD的产生。此外，在发酵中敲除KshA和KstD基因的突变菌株，提高了4‑AD产量，减少了杂质。

【技术实现步骤摘要】
用于制备4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)的HGMS2菌株突变体
本申请涉及生物领域，具体地，涉及用于制备4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)的HGMS2菌株突变体。
技术介绍
类固醇起抗菌、消炎、抗病毒和抗癌治疗的作用，类固醇的核心结构通常由三个六元环己烷环和一个五元环戊烷环组成。高级甾体药物的合成依赖于最重要的起始原料4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。4-AD的生产更为重要，因为后者可以由4-AD合成。目前，4-AD是由含有不完全甾体降解途径的细菌对植物甾醇进行生物转化而产生的环境友好型物质(使用具有不完整类固醇降解途径的细菌通过植物甾醇的生物转化以环境友好的方式生产4-AD)。尽管许多放线菌都含有类固醇降解途径，包括假单胞菌NCIB10590和单形诺卡氏菌VKMAc-2033D，但是只有分枝杆菌属的菌株才适合工业应用。从自然界中分离出来的分枝杆菌NRRLB-3805是第一种用于将植物甾醇工业规模转化为4-AD的细菌。随后还分离出了用于工业应用的其他分枝杆菌菌株，例如分枝杆菌NwIB-01和分枝杆菌HGMS2。到目前为止，所有这些菌株都属于新金分枝杆菌组。然而，这些菌株在植物甾醇转化过程中产生多个4-AD类似物，使得4-AD产量的提高及其在工业中的纯化遇到困难。在过去的十年中，细菌类固醇降解途径的分子机制的揭示得益于关键酶的生化特性、基因簇的识别以及对分解类固醇的不同细菌的基因组注释的综合信息。总的来说，9,10-开环甾类化合物的形成是一个核心通路，并进一步扩展为三条通路，即胆固醇降解途径、胆酸降解途径和睾丸激素降解途径。调控细菌降解植物甾醇涉及的基因多达260个。用于植物甾醇生物转化的工业微生物主要利用胆固醇降解途径来氧化3-羟基并降解植物甾醇的侧链，然后积累类固醇中间体。M.NRRLB-3805在不完全降解4-AD的情况下，使用11种酶连续14个步骤分解植物甾醇。耻垢分枝杆菌有一个与胆固醇降解途径不同的额外基因簇，用于C和D甾体环的代谢。红球菌RHA1菌株的胆固醇降解途径对ADD和3,4-DHSA的降解表现出更强的活性。新金黄色葡萄球菌ATCC25795中的胆固醇降解途径使用羟类固醇脱氢酶(Hsd4A)作为分子开关，以区分两种竞争性分支途径，即固醇侧链降解的AD和HBC子途径。在细菌的胆固醇降解途径中，两个最重要的关键酶3-甾酮-1，2脱氢酶(KstD)和3-甾酮-9α-羟化酶(Ksh)在C9,10位引起B环断裂。KstD是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性酶，可在3-酮类固醇底物A环的C1和C2原子之间的位置引入双键。在NCBI蛋白质数据库中的一项搜索显示，超过500种不同的微生物含有推测的KstD酶基因，主要在放线菌门属中。重要的是，单个物种可能包含多个底物特异性的KstD。例如，红球菌菌株有三种不同的KstD基因。新金分枝杆菌DSM1381也含有三种不同的KstD酶基因，而GordonianeofelifaecisNRRLB-59395含有多达五个KstD酶基因。每个菌种每个KstD酶在氨基酸序列和三维构象方面均表现出独特性。尽管已采用传统的UV或者化学介导的突变策略和现代代谢工程技术来提高4-AD和其他固醇化合物的生产率，但由于植物甾醇降解途径的复杂性，相关进展并不显著。
技术实现思路
为了解决上述问题，本申请提供了一种用于制备4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)的HGMS2菌株突变体，其中，所述HGMS2菌株突变体的KstD和Ksh基因被敲除。在上述HGMS2菌株突变体中，其中，所述HGMS2菌株突变体不能生成KstD酶KstD211，并且不能生成Ksh酶KshA226、KshA395和KshB122中的至少一种。敲除KstD和Ksh基因的HGMS2菌株与野生型HGMS2菌株相比，敲除型菌株显著降低了ADD和9-OH-AD的产生。此外，在发酵中敲除KshA和KstD基因的突变菌株，提高了4-AD产量，减少了杂质。附图说明图1示出了KstD和Ksh酶负责M.sp.HGMS2中植物甾醇分解代谢过程的4-AD积累及其降解。其中，类固醇的核心结构包含四个环，即在植物甾醇上标记的环A、B、C和D。随后的步骤涉及9a-OH-4-androstadiene-3,17-dione(9-OH-ADD)，后者是一种过渡中间体，同时会转化为HSA。4-AD：4-雄烯酮-3，17-二酮；ADD：1,4-雄烯酮-3,17-二酮；HSA：3-羟基-9,10-二十二烷基-1,3,5(10)-三烯-9,17-二酮；9OH-AD：9α-羟基雄烷-4-烯-3,17-二酮。图2示出了大规模M.sp.HGMS2提取物的HPLC图谱。与4-AD和ADD相比，使用β-谷甾醇作为唯一碳源的发酵在144h时。1.4-AD；2.ADD；3.9OH-AD；4.BA；*：当菌株在没有植物甾醇的情况下培养时，未知的代谢产物。BA：21-羟基-20-甲基pregn-4-烯-3-酮。图3示出了用于敲除HGMS2中的KstD和Ksh基因的基因敲除载体的构建。a).基于p2NIL质粒构建了同源重组载体。U：上游序列；D：下游序列。b).构建的用于从HGMS2菌株中敲除四个靶向基因的重组载体列表。c).p2NILSac-KstD载体的PCR验证。M：DNA标记；WT：M.sp.HGMS2基因组PCR产物，包括KstD基因及其从扩增的上游和下游序列；KstD-ko：从p2NILSac-KstD载体扩增的PCR产物。d).p2NILSac-KshA226和p2NILSac-KshA395载体的PCR验证。M：DNA标记；KshA226-1和KshA226-2：从带有p2NILSac-KshA226载体的推定菌落扩增的两个PCR产物；KshA395-1和KshA395-2：从带有p2NILSac-KshA395载体的推定菌落扩增的两个PCR产物。WT：M.sp.HGMS2基因组PCR产物，包括KshA226基因及其从扩增的上游和下游序列。e).敲除p2NILSac-KshB122载体的PCR验证。M：DNA标记；KshB122：从带有p2NILSac-KshB122载体的推定菌落扩增的PCR产物。图4示出了从HGMS2敲除KstD211基因消除了植物甾醇转化过程中ADD的产生。a).从琼脂糖凝胶电泳分析从推定的KstD敲除菌落扩增的PCR产物，并与从WT菌株扩增的PCR产物进行比较。M：DNA标记；WT：从M.sp.HGMS2基因组扩增的PCR产物；KstD1和KstD2：两个推定的KstD敲除突变体。b).KstD1突变体植物甾醇转化中提取的分解代谢物的TLC测定，与WT菌株以及4-AD和ADD的标准品相比。9OH-AD的带标记有箭头。c).与WT菌株相比，HGMS2hKstD1突变体使用β-谷甾醇作为唯一碳源的植物甾醇发酵提取物的HPLC图谱在144h时的谱图。1.4-AD；2.ADD；3.9OH-AD；4.BA；*：当本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)的HGMS2菌株突变体，其中，所述HGMS2菌株突变体的KstD和Ksh基因被敲除。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于制备4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)的HGMS2菌株突变体，其中，所述HGMS2菌株突变体的KstD和Ksh基因被敲除。


2.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏正定，成细瑶，周曦，
申请(专利权)人：武汉艾默佳华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42