一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌发酵液置于托盘中，在发酵液高度2～4mm的条件下进行薄层平摊培养，直至形成菌膜，干燥；所述枯草芽孢杆菌发酵液是用发酵培养基对枯草芽孢杆菌发酵培养得到。发酵培养时，先在发酵罐中培养，能够让枯草芽孢杆菌在发酵培养基中形成绝对种群优势，降低杂菌的感染率，然后将发酵液转移到托盘中薄层平摊培养，增大了发酵液与空气的接触面积，能够促使菌体快速繁殖；并且在培养过程中，能够形成一层高活性的褶皱型菌膜，最终得到浓度高达4200亿cfu/g的枯草芽孢杆菌制剂。

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法
本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法。
技术介绍
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，因易在枯草浸汁中繁殖而得名。枯草芽孢杆菌无荚膜，有鞭毛，能活动，革兰氏染色为阳性，芽孢((0.6～0.9)μm×(1.0～1.5)μm)位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大；菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时常形成皱壁，为好氧型细菌；可以利用蛋白质、多种糖，分解色氨酸。枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的益生菌之一，相对其他益生菌，是较早应用到饲料中的微生态制剂，其可有效调节动物肠道微生态平衡。枯草芽孢杆菌为需氧菌，其产酶能力较强，能产生蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶等，同时可降解饲料中的抗营养因子，提高动物的消化吸收率，从而促进动物生长。枯草芽孢杆菌对动物肠道的调节主要表现为以下几点：(1)枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。(2)枯草芽孢杆菌迅速消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，间接抑制其它致病菌生长。(3)刺激动物(人体)免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。(3)枯草芽孢杆菌菌体自身合成α～淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体(人体)内的消化酶类一同发挥作用。(4)能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体(人体)内干扰素和巨噬细胞的活性。目前，市售的枯草芽孢杆菌制剂，常用液态发酵的方法，发酵结束后将发酵液提纯、干燥得到枯草芽孢杆菌制剂，活菌数大多仅为200亿cfu/g，活菌密度较低，枯草芽孢杆菌制剂产品没有市场竞争力。现有技术中，也有采用固态发酵的方法提高活菌密度的发酵方法，例如申请公布号为CN101654665A的中国专利技术专利申请公开一种制备枯草芽孢杆菌的方法，采用经过菌种培养、种子罐培养后的活芽孢浓度约为100亿个/mL的种子液与麸皮、稻草粉、玉米粉组成的固体培养基等比例混合后进行固体发酵培养72～90小时，干燥后，得到高浓度的枯草芽孢杆菌，芽孢数约为1000亿/g。上述高浓度枯草芽孢杆菌的培养方法使用液固两相联合发酵的工艺，发酵培养过程简单，但活菌数的提高程度有限、发酵时间长，并且存在固体发酵培养劳动强度大的问题，不适于大规模的工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，以解决现有的制备方法发酵培养时间长、制剂中活菌数不高的问题，显著提高枯草芽孢杆菌制剂的活菌数。为实现上述目的，本专利技术的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法的具体技术方案为：一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌发酵液置于托盘中，在发酵液高度2～4mm的条件下进行薄层平摊培养，直至形成菌膜，干燥，即得；所述枯草芽孢杆菌发酵液是用发酵培养基经枯草芽孢杆菌发酵培养得到。本专利技术的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，将枯草芽孢杆菌发酵液置于托盘中薄层平摊培养，增大了发酵液与空气的接触面积，让菌体的供氧更加充足，能够实现快速繁殖；高度为2～4mm的发酵液在托盘中薄层平摊培养枯草芽孢杆菌，能够使得枯草芽孢杆菌在发酵液表面快速增殖，形成一层高活性的褶皱型菌膜，同时发酵液中水分含量大量减少，便于培养完成后在烘箱中快速烘干，使得最终所得枯草芽孢杆菌制剂中活菌数显著提高。进一步的，枯草芽孢杆菌发酵液中活菌数为1～10亿cfu/mL。使用较高浓度的枯草芽孢杆菌发酵液，能够让枯草芽孢杆菌在发酵培养基中形成相对种群优势，降低杂菌的感染率，并且提高托盘中的初始活菌浓度，有利于薄层平摊培养后获得高浓度的枯草芽孢杆菌制剂，浓度高达4200亿cfu/g。选择合适的培养条件有利于枯草芽孢杆菌快速增殖，薄层平摊培养的条件为：培养温度35～42℃，培养时间10～15h。培养结束后，干燥的条件为：干燥温度60～65℃，干燥时间8～12h，具体是将培养后的发酵液随托盘放入无菌干燥箱中进行干燥处理。上述发酵培养过程中使用的发酵培养基由豆粕粉、玉米淀粉、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、无机盐、蛋白酶、淀粉酶与水制成，各组分的用量为：豆粕粉63～74g/L，玉米淀粉82～90g/L，玉米浆3～5g/L，牛肉膏2～3g/L，蛋白胨8～12g/L，葡萄糖8～12g/L，蛋白酶2～3g/L，淀粉酶2～3g/L，其中，所述无机盐的种类及用量为：氯化钠2～4g/L，碳酸钙3～5g/L，磷酸氢二钾0.4～1.2g/L，氯化铁0.3～0.8g/L，硫酸锰0.03～0.08g/L。该发酵培养基，以葡萄糖、玉米淀粉作为碳源，其中葡萄糖为速效碳源，玉米淀粉为缓效碳源；豆粕粉、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨作为氮源，其中豆粕粉为缓效氮源，玉米浆、牛肉膏、蛋白胨为速效氮源；无机盐中包括枯草芽孢杆菌生长所需的大量元素磷、硫、钾、钠、钙、铁等及微量元素锰；碳源、氮源配比合理，并且各自组成中的速效组分、迟效组分也配比合理，有利于为枯草芽孢杆菌提供适宜生长的营养环境。本专利技术选用成本较低的豆粕粉和玉米淀粉作为主要原料，降低了生产成本；通过豆粕粉和玉米淀粉的分步酶解，提高了发酵培养基的营养成分和利用效率，有利于枯草芽孢杆菌制剂中活菌数保持在较高的水平。上述发酵培养基中所用的蛋白酶、淀粉酶的酶活力为1800～2000U/g，所用玉米浆中干物质含量为46.6～49.2％，总氮含量为3.33～3.67％。枯草芽孢杆菌发酵液由包括以下步骤的方法进行制备：1)先将枯草芽孢杆菌菌种接种到一级种子培养基中，37～40℃培养6～8h，得到种子培养液；再将所述种子培养液以体积百分比1～5％接种到二级种子培养基中，37～40℃培养4～6h，即得枯草芽孢杆菌种子液；2)将步骤1)所得枯草芽孢杆菌种子液接种到所述发酵培养基中发酵培养。枯草芽孢杆菌菌种经过一级、二级种子培养基的扩大培养，所得枯草芽孢杆菌种子液中的枯草芽孢杆菌处于对数期，生命力旺盛，接种到发酵培养基后能够迅速增殖。进一步的，步骤2)中所述接种的接种量为体积百分比8～12％，选择合适的接种量以保证枯草芽孢杆菌菌种在发酵罐中的密度适宜，利于菌体生长。进一步的，步骤2)中所述发酵培养的条件为：发酵温度37～40℃，搅拌速度170～240r/min，发酵培养时间6～8h。为在短时间内获得数量大、质量高的枯草芽孢杆菌菌种，以满足后续发酵生产的需要，选择营养丰富、完全的营养物质，选择容易被菌体吸收利用的碳源和氮源。所述一级种子培养基由牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖及水制成，各组分的用量为：牛肉膏3～5g/L，蛋白胨12～15g/L，氯化钠3～6g/L，葡萄糖5～10g/L。所述二级种子培养基由牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖及水制成，各组分的用量为：牛肉膏3～6g/L，酵母本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌发酵液置于托盘中，在发酵液高度2～4mm的条件下进行薄层平摊培养，直至形成菌膜，干燥，即得；所述枯草芽孢杆菌发酵液是用发酵培养基经枯草芽孢杆菌发酵培养得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌发酵液置于托盘中，在发酵液高度2～4mm的条件下进行薄层平摊培养，直至形成菌膜，干燥，即得；所述枯草芽孢杆菌发酵液是用发酵培养基经枯草芽孢杆菌发酵培养得到。


2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌发酵液中枯草芽孢杆菌中活菌数为1～10亿cfu/mL。


3.根据权利要求1所述的高浓度枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述薄层平摊培养的条件为：培养温度35～42℃，培养时间10～15h。


4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述干燥的条件为：干燥温度60～65℃，干燥时间8～12h。


5.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基由豆粕粉、玉米淀粉、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、无机盐、蛋白酶、淀粉酶与水制成，各组分的用量为：豆粕粉63～74g/L，玉米淀粉82～90g/L，玉米浆3～5g/L，牛肉膏2～3g/L，蛋白胨8～12g/L，葡萄糖8～12g/L，蛋白酶2～3g/L，淀粉酶2～3g/L，其中，所述无机盐的种类及用量为：氯化钠2～4g/L，碳酸钙3～5g/L，磷酸氢二钾0.4～1.2g/L，氯化铁0.3～0.8g/L，硫酸锰0.03～0.08g/L。


6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱广跃，李克克，谢璐璐，冯利菲，李光华，韩亚坤，买超梁，韩娅楠，
申请(专利权)人：河南金百合生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41