一种抗CLEC14A嵌合抗原受体、及其修饰的T细胞和应用制造技术

本发明专利技术提供一种抗CLEC14A嵌合抗原受体，所述抗原受体，包括CLEC14A单链抗体；所述CLEC14A单链抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示，所述CLEC14A单链抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示；本发明专利技术所述抗CLEC14A嵌合抗原受体修饰的T细胞，以表达人源化CLEC14A抗原的CHO细胞作为靶细胞进行体外杀伤试验，效靶比为1:1时，IFN‑γ的释放量为3100‑3110 pg/mL，效靶比为5:1时，IFN‑γ的释放量为6945‑6955 pg/mL，效靶比为10:1时，IFN‑γ的释放量为9300‑9310pg/mL，对靶细胞的杀伤效果好，且安全性高。

【技术实现步骤摘要】
一种抗CLEC14A嵌合抗原受体、及其修饰的T细胞和应用
本专利技术涉及一种抗CLEC14A嵌合抗原受体、及其修饰的T细胞和应用，属于生物医药

技术介绍
近年来，CAR-T细胞在B细胞恶性血液系统肿瘤治疗中取得了惊人的突破。例如，在临床应用中，CAR-T细胞对CD19阳性的难治复发白血病细胞的靶向杀伤作用及高缓解率（80~90%）的临床疗效。这一事实不仅再次证实了免疫细胞治疗的临床价值，同时也激发了学者对于实体肿瘤相关抗原和CAR-T细胞技术的拓展热情。肿瘤血管生成是实体瘤生长过程中公认的限速过程，在肿瘤进展中起着重要作用。没有血液供应的肿瘤在大小上受到限制，因此预防或限制肿瘤血管生成可能是实体肿瘤的一种治疗选择。内皮细胞在血管系统发育后通常保持静止，无新生血管形成，除了创面愈合时血管形成。然而，在实体瘤生长过程中，血管的形成可能是由于肿瘤分泌的因子刺激内皮细胞生成新的毛细血管芽而引起的。暴露于不同条件下的肿瘤内皮细胞，与正常组织中的细胞相比，将产生不同的转录组；肿瘤内皮细胞中肿瘤内皮标志物的表达水平高于正常血管内的内皮细胞。因此，可以通过靶向肿瘤内皮标志物来靶向肿瘤内皮细胞。CLEC14A，是一种单通道I型跨膜糖蛋白，属于血管表达钙依赖性C型凝集素家族14成员。研究表明，CLEC14A通过与细胞外基质的相互作用，对内皮迁移和血管新生有调节作用。据报道，CLEC14A在许多常见的人类癌症血管内壁内皮细胞表面高表达，包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌和卵巢癌等，但在健康组织的血管系统中，表达量低或不表达。目前针对肿瘤血管生成的嵌合抗原受体主要为VEGF靶点，CLEC14A是最近发现的作为肿瘤血管内皮标志物。针对CLEC14A为靶点的研究主要为抗体，比如Taek-keunKim、MKki等的文章，其可以抑制肿瘤血管的生成，目前还没有抗CLEC14A单链抗体的嵌合抗原受体。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术提供一种抗CLEC14A嵌合抗原受体、及其修饰的T细胞和应用，实现以下专利技术目的：对肿瘤具有抑制肿瘤血管生成的能力，同时抑制肿瘤生长的效果好。为解决上述技术问题，本专利技术采取以下技术方案：一种抗CLEC14A嵌合抗原受体，所述抗原受体，包括CLEC14A单链抗体；所述CLEC14A单链抗体的重链氨基酸序列为SEQIDNO.7所示，所述CLEC14A单链抗体的轻链氨基酸序列为SEQIDNO.8所示。以下是对上述技术方案的进一步改进：所述CLEC14A单链抗体的核苷酸人工序列为SEQIDNO.12所示。所述抗CLEC14A嵌合抗原受体，包括自杀基因、引导子、CLEC14A单链抗体、铰链跨膜区、共刺激区、胞内信号传导区。所述自杀基因为RQR8；所述共刺激区为CD226-CD28。所述抗CLEC14A嵌合抗原受体的序列为SEQIDNO.13所示。一种抗CLEC14A嵌合抗原受体修饰的T细胞，所述T细胞，包含抗CLEC14A嵌合抗原受体。所述T细胞的制备为将包含抗CLEC14A嵌合抗原受体的质粒进行包装得到慢病毒，然后感染活化的T细胞。所述T细胞为CD4+T细胞，CD69的表达率为50-55%。所述慢病毒，病毒滴度为2-3×108TU/mL。一种抗CLEC14A嵌合抗原受体的应用，所述抗CLEC14A嵌合抗原受体可以用于制备治疗肿瘤的药物，所述肿瘤为具有血管生成的实体瘤。所述肿瘤包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌和卵巢癌。本专利技术取得的技术效果：（1）本专利技术所述抗CLEC14A嵌合抗原受体修饰的T细胞，以表达人源化CLEC14A抗原的CHO细胞作为靶细胞进行体外杀伤试验，效靶比为1:1时，IFN-γ的释放量为3100-3110pg/mL，效靶比为5:1时，IFN-γ的释放量为6945-6955pg/mL，效靶比为10:1时，IFN-γ的释放量为9300-9310pg/mL，对靶细胞的杀伤效果好。（2）本专利技术所述抗CLEC14A嵌合抗原受体修饰的T细胞，进行体内毒性实验，并未观察到小鼠有异常的行为表现，小鼠的体重增加没有明显差异，且血液中检测到CAR-T细胞持续存在35天；解剖小鼠后对主要组织的病理观察，CAR-T小鼠并没有发现组织的病变。（3）本专利技术所述抗CLEC14A嵌合抗原受体修饰的T细胞对C57BL6小鼠肿瘤生长的抑制作用好，且细胞活性受自杀基因系统的控制；从第一次免疫CAR-T细胞起15天内，70%的小鼠均有不同程度肿瘤体积缩小，小鼠肿瘤体积减小了31-32%，第30天，小鼠肿瘤体积减小了57-58%。（4）本专利技术所述抗CLEC14A嵌合抗原受体修饰的T细胞，具有抑制肿瘤血管生成的能力，从第一次免疫CAR-T细胞起算，第35天解剖小鼠，将肿瘤包埋，制备切片，检测肿瘤的微血管密度平均仅有5.2±1.23。附图说明图1为CAR-CLEC14A整体结构示意图；图2为流式细胞术检测T细胞活化指标CD69的表达率的流式图；图3为慢病毒转染293T细胞的荧光图；图4为CAR-CLEC14A-1对活化后的T细胞的感染率的流式图；图5为CAR-CLEC14A-2对活化后的T细胞的感染率的流式图；图6为CAR-CLEC14A-3对活化后的T细胞的感染率的流式图；图7为CAR-CLEC14A-4对活化后的T细胞的感染率的流式图；图8为空载对活化后的T细胞的感染率的流式图；图9为不同CAR-CLEC14A修饰活化的T细胞的IFN-γ的释放量；图10为CAR-T细胞验证体内毒性实验中小鼠体重的变化图；图11为CAR-T细胞对C57BL6小鼠肝癌肿瘤生长的抑制效率图；图12为实施例7检测的肿瘤微血管密度；图13为CLEC14A-1、CLEC14A-2、CLEC14A-3、CLEC14A-4四个序列的重链氨基酸对比；图14为CLEC14A-1、CLEC14A-2、CLEC14A-3、CLEC14A-4四个序列的轻链氨基酸对比。具体实施方式实施例1一种抗CLEC14A嵌合抗原受体修饰的T细胞所述抗CLEC14A嵌合抗原受体，包括CLEC14A单链抗体，该单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，本专利技术中选取了4种氨基酸序列不同的人源化CLEC14A单链抗体，分别为CLEC14A-1、CLEC14A-2、CLEC14A-3、CLEC14A-4，四种单链抗体的氨基酸序列如下：CLEC14A-1的VH区为SEQIDNO.1，VL区为SEQIDNO.2CLEC14A-2的VH区为SEQIDNO.3，VL区为SEQIDNO.4CLEC14A-3的VH区为SEQIDNO.5，VL区为SEQIDNO.6CLEC14A-4的VH区为SEQIDNO.7，VL区为SEQIDNO.8...

【技术保护点】
1.一种抗CLEC14A嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗原受体，包括CLEC14A单链抗体；/n所述CLEC14A单链抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示，所述CLEC14A单链抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗CLEC14A嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗原受体，包括CLEC14A单链抗体；
所述CLEC14A单链抗体的重链氨基酸序列为SEQIDNO.7所示，所述CLEC14A单链抗体的轻链氨基酸序列为SEQIDNO.8所示。


2.根据权利要求1所述的一种抗CLEC14A嵌合抗原受体，其特征在于：所述CLEC14A单链抗体的核苷酸人工序列为SEQIDNO.12所示。


3.根据权利要求1所述的一种抗CLEC14A嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗CLEC14A嵌合抗原受体，包括自杀基因、引导子、CLEC14A单链抗体、铰链跨膜区、共刺激区、胞内信号传导区。


4.根据权利要求3所述的一种抗CLEC14A嵌合抗原受体，其特征在于：所述自杀基因为RQR8；所述共刺激区为CD226-CD28。


5.一种抗CLEC14A嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于：所述T细胞，包含抗CLEC14A嵌合...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明录，韩庆梅，张传鹏，王立新，金海锋，李希鹏，强邦明，冯建海，王亮，
申请(专利权)人：山东兴瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37