一种改进的丛枝菌根孢子密度快速测定方法技术

菌根生物技术是目前应用于煤矿区生态治理的一种新方法，菌根孢子密度是衡量菌根生态适应性的标准之一。孢子密度的测定采用的优化方法是湿筛倾析染色法。优化方案中采用曲利本蓝对基质中的孢子、菌丝进行染色，发现经染色后基质中的孢子及其菌丝呈紫色，在双目显微镜下观测孢子的数量和形态更容易识别，计数的精度和速度明显提高，降低了孢子密度测定过程中的人为误差。使用本发明专利技术的方法对孢子密度常规测定方法－湿筛倾析法作了改进发明专利技术，以提高了试验测定的精度和速度，为检验菌根技术在野外大规模的生态应用效果提供了一种孢子密度快速测定方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微生物菌根真菌学中孢子密度测定方法，具体涉及一种丛枝菌根真菌孢子密度快速测定方法。
技术介绍
丛枝菌根真菌是自然界中普遍存在的一种土壤微生物(简称AM)。陆地90％以上的有花植物都能够与它形成菌根共生体，菌根对煤矿区生态修复具有明显的生态效应。丛枝菌根真菌由菌根孢子(果)、丛枝体、泡囊、菌丝组成，都可以作为繁殖体。孢子不仅是作为丛枝菌根真菌营养储存的器官，也是一种稳定的繁殖体，它的形态特征目前仍是丛枝菌根真菌分类学的重要依据。选用丛枝菌根真菌孢子作为接种源，不仅可以得到单一的菌根，而且也可以通过菌根真菌孢子的萌发来了解菌根真菌对外界条件的适应程度。因此，适生的菌根真菌孢子的筛选和分离对于研究菌根真菌孢子在土壤中的分布、存在数量和种类以及研究菌根在煤矿区生态恢复的适应性具有重要的意义。目前孢子收集的方法主要有湿筛倾析法、柱析法、漂浮法和离心法，但是常用的方法仍是湿筛倾析法和离心法。这些方法的共同点都是能够将菌根孢子从生长基质中富积起来，但是孢子与基质的小颗粒特别是沙粒颜色相近，不易于辨别。因此，菌根在矿区生态重建、土壤修复以及农业生物肥力等方面越来越广的应用情况下，很难达到大批量样品的菌根孢子密度快速测定。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术将提供一种能快速测定大批量样品菌根孢子密度的方法，即对孢子密度常规测定方法湿筛倾析法作了改进，本技术为快速测定大批量样品孢子密度提供科学方法。完成上述专利技术任务的方案是，包括以下步骤(1)称取一定重量的土壤标本，放在容器内用水浸泡20-30分钟，使土壤松散，如果土壤粘性很大，可加入常规的土壤分散剂；(2)选用一套洁净的、具有孔径为0.5-0.034微米的土壤筛，按孔径由大至小的顺序从上到下依次叠放，最底层用一固体物垫着，使筛面稍微倾斜；(3)用玻璃棒搅动浸泡土壤的水溶液，停置几秒钟后，使大的石砾和杂物沉淀下去，然后将悬浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一层的土壤筛上，倾倒时，集中倒在筛面的一个点上，避免整个筛面都沾有土壤溶液；(4)用清水依次轻轻冲洗停留在筛面上的筛出物，以免在上层粗筛面的剩留物中残留有丛枝菌根真菌孢子，用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个清洁的培养皿里面； (5)用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个干净的试管内，滴加曲利本蓝染色剂，放在90℃水浴锅或烘箱中加热半小时，进行染色；(6)将染色后的滤液通过细筛，并冲洗筛上的滤物，洗去染色剂，将筛出物放在干净的培养皿里，在冲洗下来的筛出物中，除许多细的沙砾和杂质外，其余为不同直径的丛枝菌根真菌的孢子；(7)将筛出物放在双目实体解剖显微镜下观察，可观测到紫色孢子。本专利技术充分挖掘了菌根真菌中繁殖体孢子(果)、菌丝用曲利本蓝染色能够染成紫色的特点，经过染色后的菌丝、菌根孢子的形态特性与筛出物的色彩差异明显，在显微镜观测下易于识别和辨认，可以显著地提高孢子密度测定的精度和速度。常规的湿筛倾析法，在双目实体解剖显微镜下观察到菌根孢子和菌丝色泽与周围的沙粒基质相近，为棕黄色，不易于辨别和测定，而利用染色法观察到的孢子和菌丝呈紫色，与周围沙粒色泽反差较大，孢子从形态特性上观测更加明显，对丛枝菌根孢子的识别则是一目了然，染色法较常规的湿筛倾析法更易于识别和辨认菌根孢子。以传统的湿筛倾析法来统计待测样品的孢子密度，10克沙土样品孢子数平均为350个，而利用染色法来测定相同样品的孢子数平均为380个，每个土壤样品精度提高了8％，提高了孢子密度测定的精度。利用常规的湿筛倾析法测定孢子密度，本试验条件下需要45-50分钟时间来计数完成一个沙土样品(10克土350个孢子)。而利用染色法则需要花费25-30分钟时间来计数完成1个样品(10克土380个孢子)，测定速度上1个样品缩短了一半时间(25-30分钟)，而对本试验野外40个土样，在测定速度上节约1000-1200分钟，即20小时。40个样品在染色过程中可以一次在水浴锅或烘箱中进行染色30分钟，耗时少，染色后能够极大地提高孢子密度测定的速度。利用该染色法，能够观测到明显的菌丝和孢子形态，易于识别、辨认和观察，能够极大地提高孢子密度测定的精度和速度，对菌根在矿区生态重建、土壤修复以及农业生物肥力等野外大规模应用后的菌根孢子密度的动态监测提供了一种快速的科学测定方法，尤其对于初学菌根技术的人更是一种可行的快速测定方法。具体实施方案实施例1(菌剂培养基质)培养基质采自北京市北沙滩地建筑沙土，在装盆前经高温高压蒸汽灭菌(121℃，2h)，自然风干，以供盆栽试验用。供试菌种真菌菌种摩西球囊菌(G.mosseae)、地表球囊菌(G.versiforme)和(G.etunicatum)分别由北京市农林科学院植物营养与资源研究所微生物室提供。供试作物玉米、高粱由中国农业科学院中农种子公司提供。播种前种子用10％H2O2浸泡10分钟，去离子水反复清洗数遍沥干备用。试验用盆试验用盆采用20cm×20cm×15cm(高×盆口直径×盆底直径)规格的白色塑料盆。盆钵用自来水清洗沥干后，75％酒精消毒，每盆装风干基质2.5kg。试验方案本研究设计4个处理菌根处理，即接种G.mosseae(处理1)、接种G.versiforme(处理2)、接种G.mosseae和G.versiforme混合菌剂(处理3)、接种G.mosseae、G.versiforme和G.etunicatum的混合菌剂(处理4)，2种供试植物，总共8个处理。其中处理1和处理2是4个重复，处理3、处理4是10个重复，总共56盆。试验在7月5日播种，1个月后每盆定苗至2株，定时定量施加Hoagland营养液，维持基质持水量在60％-80％之间，3个月后收获。基质风干后用湿筛倾析法和湿筛倾析染色法测定丛枝菌根真菌孢子数。以传统的湿筛倾析法来统计孢子密度，10克沙土样品孢子数平均为350个，需要45-50分钟时间计数完成一个样品(10克土350个孢子)；而利用湿筛倾析染色法则相同样品孢子数平均为380个，需要花费25-30分钟时间计数完成1个样品(10克土380个孢子)，从精度上每个土壤样品平均提高了8％，从测定速度上1个样品缩短了一半时间(25-30分钟)，一共有76个样品，总共可以省1900～2280分钟，即节省33～38个小时，用湿筛倾析染色法测定孢子密度极大的提高了孢子密度测定的精度和速度，该方法适于大批量样品的孢子密度测定。实施例2(菌剂在宁夏煤矸石山生态重建中的野外应用)试验用地宁夏大武口洗煤厂煤矸石山，该地位于宁夏回族自治区石嘴山市，属于中温带干旱气候区，降水稀少而集中，光照充足，蒸发强烈，空气干燥，极不利于煤矸石山植被恢复。本试验地点选择煤矸石山上，煤矸石山上铺了0.8-1m厚的河沙作为生长基质。该沙土pH为8.12，电导率EC为6.67μS/cm，最大持水量为14.48％，有效磷2.9ppm，有效氮5.27ppm，有效钾97ppm，属于极贫瘠的沙土。试验材料供试菌种为本实验室增殖培养的Glomus mosseae和Glomus etunicatum混合菌剂(简称G.spp)。供试植物是当地先锋植株白蜡幼苗，裸根栽植，株高1米左右。试验设计和管理试验在2005年4月18日种植，设接种和不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丛枝菌根真菌孢子密度快速测定方法，其特征在于包括以下步骤：（１）称取一定重量的土壤标本，放在容器内用水浸泡２０－３０分钟，使土壤松散，如果土壤粘性很大，可加入常规的土壤分散剂；（２）选用一套洁净的、具有孔径为０．５－０． ０３４微米的土壤筛，按孔径由大至小的顺序从上到下依次叠放，最底层用一固体物垫着，使筛面稍微倾斜；（３）用玻璃棒搅动浸泡土壤的水溶液，停置几秒钟后，使大的石砾和杂物沉淀下去，然后将悬浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一层的土壤筛上，倾倒时，集 中倒在筛面的一个点上，避免整个筛面都沾有土壤溶液；（４）用清水依次轻轻冲洗停留在筛面上的筛出物，以免在上层粗筛面的剩留物中残留有丛枝菌根真菌孢子，用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个清洁的培养皿里面；（５）用洗瓶将停留 在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个干净的试管内，滴加曲利本蓝染色剂，放在９０℃水浴锅或烘箱中加热半小时，进行染色；（６）将染色后的滤液通过细筛，并冲洗筛上的滤物，洗去染色剂，将筛出物放在干净的培养皿里，在冲洗下来的筛出物中，除许多细的沙 砾和杂质外，其余为不同直径的丛枝菌根真菌的孢子；（７）将筛出物放在双目实体解剖显微镜下观察，可观测到紫色孢子。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毕银丽，吴王燕，全文智，
申请(专利权)人：中国矿业大学北京，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]