一种β-兴奋剂克仑特罗免疫亲合柱及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种提取β２一兴奋剂（克仑特罗）免疫亲合柱。本发明专利技术所提供的免疫亲合柱用来提取饲料和畜产品中的违禁药物β２－兴奋剂（克仑特罗），包括β２－兴奋剂（克仑特罗）特异性抗体、偶联有β２－兴奋剂（克仑特罗）特异性抗体Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ、装载亲和材料的塑料柱、上样缓冲液、淋洗液及洗脱液。本发明专利技术的β２－兴奋剂（克仑特罗）免疫亲合柱使用方便，具有高特异性、可快速提取饲料及畜产品中残留的β２－兴奋剂（克仑特罗）。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品安全领域中违禁农兽药检测分析
具体而言，本专利技术涉及一种β-兴奋剂-克仑特罗免疫亲合层析柱其制备方法及其用途。
技术介绍
克仑特罗(Clenbuterol)俗名瘦肉精，属于β2-受体兴奋剂，曾经作为治疗哮喘的药物，目前被非法用于畜牧生产中，其不易在动物体内代谢，具有累积残留毒性，曾在国内外引起多次中毒事件。当人食用了残留有“瘦肉精”畜产品，出现严重的中毒反应，症状表现为骨骼肌收缩增加，破坏快缩肌纤维与慢缩肌纤维之间的融合，引发肌肉震颤，四肢和肌肉尤为明显，其他中毒症状包括心动过速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心和晕眩等，严重危害人体健康。因此我国严禁此类药物在饲料和动物饮用水中使用。但是由于利益驱使，在畜牧业生产中仍有非法使用。鉴于此，对动物性食品中“瘦肉精”残留进行严格检测是非常必要的。但是，目前所用的确证方法对样品要求高，前处理复杂，目前其提取方法均采用化学方法，不适应快速简单的要求，限制了监测的效率。实际工作中，由于生物样本的成分复杂，而且大多数取样量很少，这对分析方法的特异性和灵敏度提出了很高的要求。因此，有必要建立一种操作快捷，且具有很高的特异性和灵敏度的方法。免疫亲和层析技术是一种将免疫反应和层析技术相结合的分析方法，在提纯物质上是一项效率高、提纯物质纯度高、快速的技术，可以使免疫检测技术(如ELISA等)和层析技术在特异性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，避免了免疫分析法直接测定样品的不足。免疫亲和柱是上个世纪90年代在分析领域中得到应用的技术，但用免疫亲和柱提取样品中的克仑特罗尚未见报道。因此，本专利技术人通过大量试验，研制成功了一种具有高特异性和灵敏度且操作快捷的克仑特罗免疫亲合柱。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种快速提取β2-兴奋剂-克仑特罗的免疫亲合柱及其制备方法和用途。本专利技术的原理是根据抗原抗体的特异性反应和可解离的特性，用β2-受体兴奋剂-克仑特罗抗体提取食品中的β2-受体兴奋剂克仑特罗残留。一方面，本专利技术提供了一种制备克仑特罗免疫亲合柱的方法，该方法包括下列步骤a)将克仑特罗特异性抗体与溴化氰活化的Sepherose 4B胶混合，转鼓搅拌，偶联过夜；烧结玻璃滤器抽滤偶联胶，PBS洗脱未结合抗体，每次5毫升，洗4次；用1M乙醇胺封闭未结合位点，加过量乙醇胺孵育2.5小时，抽滤乙醇胺，用偶联缓冲液抽洗，然后再用HAC，Tris-Hcl缓冲液交替洗涤共4次，每次5ml；b)将偶联后的胶装入亲和层析塑料柱中，装注1ml/柱，稍用力压紧，即得所述的克仑特罗免疫亲合柱。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述的克仑特罗免疫亲合柱的制备方法具体操作为取Sepherose 4B(100-120目)湿重4g(6ml)，用0.1M pH9.5 Na2CO3溶液浸泡4小时。通风厨中称取溴化氰0.8g溶于1.2ml Na2CO3(2g溶液3ml缓冲液)，电磁搅拌10分钟。冰浴电磁搅拌下，将溴化氰溶液加入Sepherose4B中，2分钟内完成，滴加2N NaOH，使pH值保持在11，冰浴反应10分钟。将反应后的Sepherose 4B倒入布氏漏斗中，用预冷的Na2CO3溶液4-10℃洗2-3分钟内完成，抽洗25倍体积的液体准备交联蛋白。4℃下，将实施例1制备的抗体(多克隆抗体或单克隆抗体)溶液与溴化氰活化的Sepherose4B胶混合，转鼓搅拌，偶联反应过夜。烧结玻璃滤器抽滤偶联胶，PBS洗脱未结合抗体，每次5毫升，洗4次。分别测定抗体含量。用1M乙醇胺(ethanolamine)封闭未结合位点，加过量乙醇胺孵育2.5小时。抽滤乙醇胺，用偶联缓冲液抽洗。然后再用交替的HAC，Tris-Hcl缓冲液洗4次，每次5ml。最后，将偶联后的胶装入亲和层析塑料柱中，装注1ml/柱，稍用力压紧，即得到本专利技术所述的克仑特罗免疫亲合柱。另一方面，本专利技术提供了一种克仑特罗免疫亲合柱，该免疫亲合柱包括偶联有克仑特罗特异性抗体的Sepharose 4B与装载该亲和材料的塑料柱。其中所述的克仑特罗特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术所述的克仑特罗特异性抗体通过下述方法制备1)按小分子半抗原的偶联方法制备克仑特罗与载体蛋白偶联物；以及，2)用该偶联物作为免疫原免疫动物(例如，兔)，分离血清，纯化得到多克隆抗体；或者3)免疫小鼠，通过杂交瘤技术获得单克隆抗体；4)用不同载体蛋白的偶联物为包被原用于检测抗体质量。其中所述的载体蛋白包括但不限于，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、卵清蛋白和钥孔铜兰蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)。所述的克仑特罗与载体蛋白的偶联物采用重氮化法、戊二醛法、活性酯法或多元酸酐法与混合酸酐法联合方法偶联。本专利技术所述免疫亲和柱的保存条件为0.01％硫柳汞钠的磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)，4℃保存。另外，为方便现场应用，本专利技术所述免疫亲合柱还可以进一步包括上样缓冲液、淋洗液及洗脱液。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述的上样缓冲液为PBS(0.02MPB-0.05MNaCl，PH7.2)，所述的淋洗液为PBST(0.02MPB-0.05MNaCl-0.2％Tween20，PH7.2)；所述的亲合柱洗脱液为甲醇/1M乙酸(V/V为97/3)。另一方面，本专利技术提供了一种克仑特罗免疫亲合柱的使用方法，该方法包括a)取出4℃保存的免疫亲和柱及上样缓冲液、淋洗液及洗脱液，回至室温，用上样缓冲液充分淋洗亲和柱，除去储存Buffer中含的蛋白和防腐剂；b)将处理好的待检样品用上样缓冲液稀释至所需体积，上样，上样液滴干后，淋洗液淋洗柱体，弃去，吸耳球吹干柱内溶液；c)用洗脱液洗脱特异性结合的克仑特罗，收集洗脱液，保存待检。本专利技术使用饲料、猪肉及生猪尿液进行了回收率实验，结果表明克仑特罗免疫亲合柱的回收率在80％-110％之间，回收率达到了分析方法的回收率要求。因此，另一方面，本专利技术提供了所述克仑特罗免疫亲合柱在提取饲料以及动物源性产品和动物代谢物中克仑特罗残留的用途。一个具体实施方案中，所述的动物源性产品为猪肉。另一个具体实施方案中，所述的动物代谢物为猪尿。提供下述实施例是为了更好地进一步理解本专利技术，而决不对本专利技术的内容和保护范围构成任何限制。实施例实施例1抗克仑特罗多克隆抗体的制备1.1抗克仑特罗多克隆抗体的制备参考现有技术中偶联物合成方法(Itaru Yamamoto，Kohji Iwata Enzyme immunoassay forclenbuterol，an β2-adrenergic stimulant Journal of Immunoassay，3(2)，155-171(1982))，合成克仑特罗-载体蛋白偶联物。具体操作如下，称取盐酸克仑特罗31.3mg(约0.1mmol)，溶解于4ml去离子水中，用1M盐酸调pH值至1.5-2，4℃黑暗条件下逐滴加入0.1M的NaNO2，不停搅拌反应30分钟，用KI淀粉试纸检验，直至试纸变灰蓝色后停止反应，用氨基磺酸铵除去多余的NaNO2，得到重氮化的克仑特罗。取适量重氮化的盐酸克仑特罗溶液逐滴加入到10ml、0.1M pH 7.5冰冷载体蛋白PB溶液中，半小时内加完，反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备克仑特罗免疫亲合柱的方法，该方法包括下列步骤：ａ）将克仑特罗特异性抗体与溴化氰活化的Ｓｅｐｈｅｒｏｓｅ４Ｂ胶混合，用转鼓搅拌，偶联过夜；烧结玻璃滤器抽滤偶联胶，ＰＢＳ洗脱未结合抗体，每次５毫升，洗４次；用１Ｍ乙醇胺封闭未结合位点，加过量乙醇胺孵育２．５小时，抽滤乙醇胺，用偶联缓冲液抽洗，然后再用ＨＡＣ，Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ缓冲液交替洗涤共４次，每次５ｍｌ；ｂ）将偶联后的胶装入亲和层析塑料柱中，装注１ｍｌ／柱，稍用力压紧，即得所述的克仑特罗免疫亲合柱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：熊勇华，张波，王迪，杨晓慧，杨曙明，于洪侠，
申请(专利权)人：北京中德大地食品安全技术开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]