免疫测定载体制造技术

提供一种免疫测定方法，包括：（ａ）提供具有多个凹孔的测定板，凹孔中含有有抗体结合的固体支持物；（ｂ）在一个或多个但不是所有的有抗体结合的凹孔中进行测定；（ｃ）以后再在步骤（ｂ）未使用的一个或多个凹孔中进行测定。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及测定方法以及在这类测定方法中使用的测定板和试剂。具体而言，本专利技术涉及结合有抗体的微量滴定板或其他测定板，以及所述板在例如ELISPOT测定等的测定方法中的使用和再利用。
技术介绍
过滤免疫斑测定也被称为酶联免疫斑点测定(ELISPOT)，最先被开发用于检测和定量个体抗体分泌B细胞。在这种技术开发出来后，它给常规的空斑形成细胞测定提供了一种快速和多用途的备选手段。最近的改进提高了ELISPOT的灵敏度，使得可以检测到每秒产生少至100个特定蛋白质分子的细胞。这些测定利用了紧挨蛋白质分泌细胞的环境中的相对高浓度的给定蛋白质性细胞产物(例如细胞因子)。使用高亲和力抗体捕获并检测这些细胞产物。ELISPOT测定综述于CurrentProtocols in Immunology，Unit 6.19 pages 6.19.1-8。ELISPOT测定方法包括六个具体步骤(1)将纯化的细胞因子特异性抗体包被于有膜支持物的的微量滴定板上；(2)将板封闭以阻止任何其它蛋白质的非特异性吸附；(3)将分泌细胞因子的细胞与合适的试剂一起培养；(4)移去细胞和试剂；(5)加入被标记的抗细胞因子二抗；和(6)检测膜上的抗体-细胞因子复合物。ELISPOT测定方法利用针对同一细胞因子分子不同表位的两种高亲和力细胞因子特异性抗体可用两种单克隆抗体，或者一种单克隆抗体和一种多价抗血清的组合。ELISPOT基于检测单个细胞分泌的细胞因子的显色反应而产生斑点。斑点代表了产生细胞因子的原始细胞的“足迹”。斑点持久，并可通过目测、显微方法或电子手段定量。使用荧光标记的检测方法也已在本领域内有实践。促进单克隆或多克隆抗体在PVDF膜或其它固相上的包被的技术已十分成熟(Catt and Tregear(1967)；Salmon et al.(1969)和Perlmann(1972))。关键参数包括固相的预活化、抗体溶液的浓缩、包被缓冲液的pH和离子强度、包被时间和温度以及包被后的处理。需要使所有这些参数最优化以得到高浓度的包被抗体均匀分布于固相表面的微量滴定板。用于ELISPOT测定的微量滴定板中固相的预包被使得大量板之间的灵敏度和稳定性保持一致。这对于诊断样品的常规处理方法十分重要。ELISPOT测定可用于临床处置，例如每个试剂盒一次可测定24个患者的样品(用96孔板，每个样品用4个孔)。对少量体积的使用者而言，对板和试剂循环使用的方法会有很大的好处。由于例如下述的原因，很多诊所或实验室无法一次获得24个新鲜的血样在某一具体诊疗时间段内患者人数较少；或者一些实验室出于例如员工和设备等的可用性的后勤原因更愿意进行小量样品的测定。不管在哪种情况下，测定少于24个样品并且使板和试剂在以后的时间循环使用或再利用都可以大大提高实验室的效率。
技术实现思路
本专利技术中意外地发现抗体预包被的测定板和试剂可以循环使用，也就是说，可以在微量滴定板的一部分(所有孔的一部分)上进行测定，然后将板和试剂储存起来，以后在同一块板的另一部分上使用另外的测定试剂进行其它测定。根据本专利技术，提供一种免疫测定方法，包括(a)提供具有多个凹孔的测定板，凹孔中含有有抗体结合的固体支持物；(b)在一个或多个但不是所有的有抗体结合的凹孔中进行测定；(c)以后再在步骤(b)未使用的一个或多个凹孔中进行测定。附图说明图1.基于表1的结果，在乙酸盐封条封住的ELISPOT板上进行多次测试的效果。图中表示的是平均值±1标准差。图2.基于表2的结果，在乙酸盐封条封住的ELISPOT板上进行多次测试(长时程)的效果。图中表示的是平均值±1标准差。图3.基于表3的结果，在两种温度下储存的多次使用试剂与对照试剂相比的斑点计数。图中表示的是平均值±1标准差。由于孔被完全饱和，新鲜阳性的斑点计数显示出人为处理的较低读数。图4.基于表4的结果，用不同浓度的干扰素γ强化的多次使用的二抗偶联剂与ELISPOT板偶联的效果。图中表示的是饱和度百分比的平均值±1标准差。使用t检验发现在所有点得到的结果之间没有显著差异(α＝0.05)。图5.对T细胞系D454 E12用肽池2(Peptide pool2)进行短期研究(n＝12)的SFC计数的平均值±标准差。图6.对T细胞系D481 B9用肽池2进行长期研究(n＝8)的SFC计数的平均值±标准差。具体实施例方式本专利技术涉及使用具有多个凹孔或反应孔的测定板的测定方法，每个凹孔或反应孔中含有有抗体结合的固体支持物。结合的抗体用于在一个或多个凹孔或反应孔中的测定。所述测定可包括加入细胞和试剂，以及在合适的温度下培养。在第一次测定中未使用的凹孔或反应孔随后可以用于在以后的时间进行的测定中。用一块板就可在不同的时间点进行几次独立的测定。在本专利技术的一个优选方面中，测定板包括微量滴定板。所述微量滴定板是广泛使用的。这些板通常具有96个或384个孔。通常孔呈阵列排布，例如96孔板为8×12排列，384孔板为24×16排列。板上具有许多凹孔或反应孔，96孔板的孔被设计为使用约125μl样品，384孔板的孔被设计为使用约30μl样品。孔通常呈规则阵列紧密地排布。这类微量滴定板通常由例如聚丙烯的合适的塑料材料制成。例如微量滴定板的本专利技术测定板通常可由合适的塑料材料制成。凹孔或反应孔中含有有抗体结合的固体支持物。优选地，固体支持物为固体可渗透支持物。所述固体支持物通常为在凹孔底部的例如硝酸纤维素膜或PVDF膜的膜。或者固体支持物包括凹孔的固体基质，例如固体聚苯乙烯基质或被处理过以接受或增强抗体结合的基质。固体支持物上有抗体结合。抗体根据要进行的测定选择。优选地，测定为基于细胞的测定，并可以为例如ELISPOT测定的免疫斑点测定。通常，使用例如针对人类干扰素γ、IL-2或TNF-α的抗体的抗细胞因子抗体进行例如ELISPOT测定的测定。通过任何合适的手段将抗体结合于固体支持物。通常，提供有相同的抗体结合于每一凹孔或反应孔中的固体支持物的测定板。抗体为免疫球蛋白分子，这为本领域所熟知(Immunology，IvanRoitt，et al，Gower Medical Publishing，1985)。它们通常包括由硫氢键(sulphydryl bond)连接的两条“重”多肽链和两条“轻”多肽链，以高亲和力结合特定抗原的抗体种类可以按常规以单克隆或多克隆抗体种类形式产生。可以产生特异性针对细胞因子分子的典型抗细胞因子抗体，例如抗干扰素γ、IL-2、IL-10和抗TNF-α。也可以产生例如F(ab)2片段的抗体片段。原则上，只要分子保留着其抗原特异性结合位点，使其可以结合其相应半抗原/抗原，那么这些分子，包括针对例如类固醇和其它蛋白和非蛋白激素的非细胞因子半抗原/抗原的分子，都可以用于结合固相并用于本文所述类型的免疫测定。通过加入合适的测定试剂可以进行任何合适的测定。测定可包括根据测定方案在合适的温度下培养该板。通常，这类测定中包括在20至60℃之间、1至48小时的培养步骤。例如培养温度通常在25至42℃之间，例如约37℃。培养步骤进行2至24小时，例如至少4小时或至少8小时例如8至12小时，或至少12小时或至少16小时例如16至20小时。使用同一块测定板的每个测定可以相同或不同。通常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫测定方法，包括：　　　　（ａ）提供具有多个凹孔的测定板，凹孔中含有有抗体结合的固体支持物；　　　　（ｂ）在一个或多个但不是所有的有抗体结合的凹孔中进行测定；　　　　（ｃ）以后再在步骤（ｂ）未使用的一个或多个凹孔中进行测定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：TS德怀尔，SW特纳，T戴，
申请(专利权)人：牛津免疫科技有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]