本发明专利技术公开了一种微孔板ｐＨ传感器的原位制备方法，其步骤是首先将三乙氧基－３－异氰酸丙基硅烷滴入ｐＨ敏感试剂的乙醇溶液中，得反应液Ａ；其次是将硅氧烷、酸和水混合，得反应液Ｂ；第三是取反应液Ａ、反应液Ｂ及氯化钙溶液，按比例混合，得溶液Ｃ；第四是取溶液Ｃ涂于微孔板的微孔底部，用密封带将微孔封住，并用针在每个微孔中央刺孔，避光保存。放置一段时间后加蒸馏水于微孔中，保存备用。本方法简便快速，成本低，通用性强，该传感器可用于各种水解反应及与ｐＨ变化有关的化学反应的监测。用于β－内酰胺酶抑制剂及β－内酰胺抗生素筛选获得满意结果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物、医学、药学、材料、化学等学科的交叉学科领域。更具体涉及一种微孔板底部pH传感器的制备方法。
技术介绍
β-内酰胺类抗生素，如青霉素及链霉素等，是最常用的抗生素。由于在临床治疗及动物饲养等方面的广泛使用，甚至滥用，抗药性问题日益突出，甚至对继续使用抗生素治疗带来严重威胁。抗药性产生的原因是由于细菌产生β-内酰胺酶。随着抗生素的不断使用，新的酶及变种酶不断产生，抗药性问题日趋严重。β-内酰胺酶(E.C.3.5.2.6)是一类β-内酰胺水解酶，它催化水解β-内酰胺环，酰胺键断裂，生成β-氨基酸。最新研究成果表明，目前已经证实的β-内酰胺酶共有340余种。根据它们氨基酸序列及催化机理的不同，这些酶可分为A，B，C，D4类。目前常用于酶活性测定的方法主要是紫外-可见分光光度法，由于这种方法灵敏度低，因而采用微孔板进行高通量检测受到限制，劳动强度大，耗时长，影响分析结果。另外，对于米氏常数过大及催化效率过低的酶，由于底物或酶浓度高，严重干扰紫外-可见分光光度分析。米氏常数过小，初始速率测定有困难，也会干扰紫外-可见分光光度分析。高通量微孔板常用于大量样品的高通量检测，但由于微孔板多为塑料制品，如聚苯乙烯微孔板。聚苯乙烯透光性强、易成型、成本低、经久耐用，发光测定通常采用聚苯乙烯微孔板。但由于聚苯乙烯表面亲水性差，对酶等生物大分子物理吸附强，严重影响分析结果。因此聚苯乙烯微孔板内表面须进行亲水处理。常用的方法有等离子处理法、光化学氧化、化学氧化及涂层。等离子处理，如离子轰击与植入、电子束辐射等方法均需要特定的设备，成本高；光化学氧化及化学氧化需采用强酸及强氧化剂、紫外线照射等，对环境污染较大。因而微孔板内涂层法成为一种简便、适用的表面改性技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种。采用pH敏感分子与凝胶共价偶联技术，该传感膜性质稳定，对pH变化响应快，亲水性好，灵敏度高，通用性强。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施其步骤如下将1-10μL的三乙氧基-3异氰酸丙基硅烷(TESPI)滴入pH敏感试剂5-氨基荧光素(FITC)的乙醇溶液中，TESPI与FITC的摩尔比控制在为1∶1～1∶20范围内，温度在5-50℃，反应1-30小时，得反应液A，所偶联的pH敏感试剂可以是FITC；(2)将硅氧烷、0.01M酸和水按1∶1∶3～10∶1∶3比例混合，超声0.2～2.0小时，得反应液B，硅氧烷为四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷，酸为盐酸或硫酸或硝酸或磷酸等；(3)取反应液A，反应液B及0.1M氯化钙(CaCl2)溶液，按10∶10∶1～1∶1∶10的比例混合，得溶液C；(4)取溶液C1.-0～50μL于96(384或1856)孔板的微孔中，涂于微孔底部，然后用密封带将微孔封住，并用针在每个微孔板中央刺一小孔，室温(20-25℃)保存20～120小时后，加适量蒸馏水于微孔中，保存备用。传感器放置一年以上，性能基本不变(见图1～5)。本传感器用于7种商用抗生素筛选及2种细菌酶抑制剂筛选研究，可在半小时内完成。抗生素药物的筛选在0.1mL一定浓度的β-内酰胺酶和0.1MNaCl溶液中注入0.1mL的不同抗生素，根据荧光强度的变化，便可判断不同β-内酰胺酶可以水解的抗生素(见表1)。表1抗生素药物的筛选结果 √β-内酰胺酶能水解-β-内酰胺酶不能水解β-内酰胺酶抑制剂的筛选取适量β-内酰胺酶与β-内酰胺酶抑制剂混和溶液0.1mL于微孔中，将微孔板放入微孔板读数仪，再将0.1mL一定浓度的抗生素药物注射到微孔中，记录荧光强度变化曲线，根据该曲线变化即可进行抗生素药物和β-内酰胺酶抑制剂的筛选。(见表2) 表2 β-内酰胺酶抑制剂的筛选结果 本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果从pH 7.0变到pH 4.0所需时间约2分钟；荧光强度增大约7倍；(通常的文献方法只能增强2～3倍)。传感器连续使用40天后，荧光强度偏差在10％以内。传感器放置一年以上，性能基本不变。本传感器用于7种商用抗生素筛选及2种细菌酶抑制剂筛选研究，可在半小时内完成。与传统的紫外分光光度法相比，分析速度大大提高，灵敏度可提高10～100倍。此外对于米氏常数较大或较小，因而无法采用紫外可见分光光度法测定的酶、颜色较深的培养液及高背景介质，对本传感器的分析应用无干扰。附图说明图1为溶液pH变化对荧光强度的影响pH4.0，5.00.05 M邻苯二甲酸缓冲溶液pH6.0，7.0，8.00.05 M磷酸缓冲溶液pH9.012.5mM硼砂缓冲溶液图2A、2B为传感器对pH变化的响应特性及可逆性图2A为0.2mM pH7.0磷酸缓冲溶液平衡后注入0.05M pH4.0邻苯二甲酸缓冲溶液，图2B为0.05M pH4.0邻苯二甲酸缓冲溶液平衡后注入0.05M pH7.0磷酸缓冲溶液图3为传感膜的激发及发射光谱激发波长480nm，发射波长485nm图4为青霉素浓度变化对荧光强度的影响0.1mL 2.8×10-7M青霉素酶和0.1M NaCl溶液中注入0.1mL不同浓度的青霉素图5为不同浓度青霉素酶的反应动力学曲线0.1mL 2.5nM(a)和5.0nM(b)青霉素酶和0.1M NaCl溶液中注入0.1mL 10mM的青霉素溶液具体实施方式一种，其步骤为(1)将10μL的三乙氧基-3异氰酸丙基硅烷(TESPI)滴入pH敏感试剂5-氨基荧光素(FITC)的乙醇溶液中，TESPI与FITC的摩尔比控制在为1∶14，温度在5或10或15或20或25或28或31或33或36或41或46或50℃，反应1或3或5或10或15或20或24或28或30小时，得反应液A；(2)将四乙氧基硅烷0.6mL、0.01M盐酸40μL和水0.12mL混合均匀，超声1或1.5或2小时，得反应液B；(3)取反应液A 0.2mL，反应液B 0.2mL及0.1M氯化钙(CaCl2)溶液1.0mL混合均匀，得溶液C；(4)取溶液C1.0或5或10或15或20或30或40或50μL于96或384或1856孔板底部涂匀，用密封带将微孔封住，并用针在每个微孔板中央刺一小孔，室温20℃保存20或24或48或72或96或115或120小时后，加0.2mL蒸馏水于微孔中，保存备用。权利要求1.一种，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将1-10μL的三乙氧基-3-异氰酸丙基硅烷滴入pH敏感试剂的乙醇溶液中，摩尔比为1∶1～1∶20，温度在5-50℃，反应1～30小时，得反应液A；(2)将硅氧烷、0.01M酸和水按1∶1∶3～10∶1∶3比例混合，超声0.2～2小时，得反应液B；(3)取反应液A、反应液B及0.1M氯化钙溶液，按10∶10∶1～1∶1∶10的比例混合，得溶液C；(4)取溶液C1.0～50μL于96或384或1856孔板底部，用密封带将将微孔板的微孔封住，并用针在每个微孔中央刺一小孔，室温保存20～120小时后，加蒸馏水于微孔中，保存备用。2.根据权利要求1所述的一种，其特征在于微孔板为聚苯乙烯微孔板或玻璃微孔板。3.根据权利要求1所述的一种，其特征在于硅氧烷为四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷。4.根据权利要求1所述的一种，其特征在于酸为盐酸或者是硫酸、硝酸、磷酸。5.根本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微孔板ｐＨ传感器的原位制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤： （１）将１－１０μＬ的三乙氧基－３－异氰酸丙基硅烷滴入ｐＨ敏感试剂的乙醇溶液中，摩尔比为１∶１～１∶２０，温度在５－５０℃，反应１～３０小时，得反应液Ａ； （２）将硅氧烷、０．０１Ｍ酸和水按１∶１∶３～１０∶１∶３比例混合，超声０．２～２小时，得反应液Ｂ； （３）取反应液Ａ、反应液Ｂ及０．１Ｍ氯化钙溶液，按１０∶１０∶１～１∶１∶１０的比例混合，得溶液Ｃ； （４）取溶液Ｃ１．０～５０μＬ于９６或３８４或１８５６孔板底部，用密封带将将微孔板的微孔封住，并用针在每个微孔中央刺一小孔，室温保存２０～１２０小时后，加蒸馏水于微孔中，保存备用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何治柯，刘红兵，梁润松，黄国贤，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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