一种针对新型冠状病毒的DC疫苗、制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，所述DC疫苗，包括COVID‑19的S蛋白、趋化因子CCL19。本发明专利技术用自体外周血制作DC疫苗安全性高，没有排斥反应。相比其他疫苗来说持续时间长，能更快的识别抗原，启动T细胞的杀伤功能，同时产生抗体，体外试验中，DC疫苗联合CIK在4h时就已经启动对靶细胞的杀伤；本发明专利技术制备的2019nCOV‑S‑CCL19 DC疫苗与CIK细胞联合杀伤实验效果好，体外试验中，两者联合使用，与靶细胞混合24h进行检测，在效靶比10:1时，对靶细胞的细胞毒性高达93.2％，在效靶比5:1时，对靶细胞的细胞毒性高达68.6%。

【技术实现步骤摘要】
一种针对新型冠状病毒的DC疫苗、制备方法及其应用
本专利技术涉及一种针对新型冠状病毒的DC疫苗、制备方法及其应用，属于生物医药

技术介绍
树突状细胞（Dendriticcells，DC）是最有效的专业抗原提呈细胞（APC），在调节先天性和适应性免疫反应中发挥着重要作用。在其未成熟状态下，DC在组织微环境中巡逻，并在外来病原体的存在下被激活。这种激活是在外源性危险信号通过Toll样受体（TLR）等模式识别受体（PRR）刺激后发生的，并导致DC向引流淋巴结的迁移和处理过的表位向T细胞的呈现。在T细胞活化过程中，DC与T细胞受体（TCR）结合，分泌特异性细胞因子，并根据细胞因子环境刺激对TH1、TH2或Tregs的免疫反应。最新研究表明，在COVID-19与SARS病毒S蛋白的保守性最高，其在结合细胞受体和介导病毒与宿主细胞膜的融合过程中起着重要作用，在COVID-19感染过程中是中和病毒感染的主要靶标。因此，选取COVID-19病毒的S蛋白作为抗原，刺激培养的DC细胞，制备成DC疫苗，可以快速识别病毒，并呈递给T细胞，启动T细胞的杀伤作用。国内已采取多种技术手段快速开发新型冠状病毒疫苗(COVID-19)。为加快疫苗开发速度并提高成功率，国家同时开发多种候选疫苗，包括灭活疫苗、减毒疫苗、核酸疫苗、DC疫苗。目前国内外用于新冠病毒的疫苗还没有上市，但国内开发速度最快的核酸疫苗已经入Ⅱ期临床，其次两款灭活疫苗已获得临床审批。灭活疫苗、减毒疫苗、核酸疫苗其作用机制均作为抗原刺激体内的组织细胞，通过一系列的反应刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，在体内形成抗体。这三种疫苗主要通过肌肉注射进入体内，肌注后被肌肉细胞提取的抗原仅有很少一部分，所以对其在体内是否有抗体的形成，是无法预测的。DC疫苗主要是负载相关的抗原，由于DC细胞不增殖，现有的DC疫苗发挥的作用处于一般水平。由于新冠病毒是新发现的病毒，目前还没有相应的DC疫苗。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种针对新型冠状病毒的DC疫苗、制备方法及其应用，采集自体外周血分离出单核细胞培养成DC细胞，利用COVID-19的S蛋白作为抗原刺激DC细胞，并整合到DC细胞中，回输到体内，起到预防与治疗的作用；实现以下专利技术目的：本专利技术的DC疫苗缩短T细胞识别抗原的时间，更加快速启动体内的免疫应答反应；和CIK细胞联用，提高CIK细胞对COVID-19病毒的杀伤效果。为解决上述技术问题，本专利技术采取以下技术方案：一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，所述DC疫苗，包括COVID-19的S蛋白、趋化因子CCL19。以下是对上述技术方案的进一步改进：所述COVID-19的S蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示；所述CCL19的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示。所述DC疫苗，包括融合基因片段CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19。所述CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19的核苷酸序列为SEQIDNO.6所示。一种针对新型冠状病毒的DC疫苗的制备方法，所述制备方法，包括S蛋白抗原表达载体的构建、腺相关病毒的包装、感染DC细胞。所述S蛋白抗原表达载体的构建，将融合基因片段CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19，插入腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP，得到重组腺相关病毒表达载体pAAV-2019nCOV-S-CCL19，质粒浓度高于200ng/ul。所述腺相关病毒的包装，将重组腺相关病毒表达载体pAAV-2019nCOV-S-CCL19转染HEK293细胞，得到pAAV-2019nCOV-S-CCL19腺病毒，病毒滴度为1.2-1.3×108TU/ml。一种针对新型冠状病毒的DC疫苗的应用，所述DC疫苗用于预防和治疗新型冠状病毒COVID-19。所述DC疫苗和CIK细胞联合使用，所述CIK细胞和DC细胞的数量比为9.5-10.5：1。与现有技术相比，本专利技术取得以下有益效果：（1）本专利技术用自体外周血制作DC疫苗安全性高，没有排斥反应。相比其他疫苗来说持续时间长，能更快的识别抗原，启动T细胞的杀伤功能，同时产生抗体，体外试验中，DC疫苗联合CIK在4h时就已经启动对靶细胞的杀伤。（2）本专利技术制备的2019nCOV-S-CCL19DC疫苗可以提高CIK细胞对新型冠状病毒COVID-19细胞的杀伤效果；本专利技术的2019nCOV-S-CCL19DC疫苗与CIK细胞联合杀伤实验，CIK细胞和DC细胞的数量比为9.5-10.5：1，与靶细胞混合24h进行检测，在效靶比10:1时，对靶细胞的细胞毒性高达93.2％，在效靶比5:1时，对靶细胞的细胞毒性高达68.6%。附图说明图1为实施例2质粒转染包装成腺相关病毒的免疫荧光显微镜图；图2为实施例3制备的未成熟的DC细胞；图3为实施例3制备的成熟的DC细胞；图4为DC细胞表面标志物CD80的表达率的流式图；图5为DC细胞表面标志物CD83的表达率的流式图；图6为DC细胞表面标志物CD86的表达率的流式图；图7为pAAV-2019nCOV-S感染DC细胞后GFP表达率的流式图；图8为pAAV-2019nCOV-S-CCL19感染DC细胞后GFP表达率的流式图；图9为不同效靶比下DC疫苗联合CIK细胞对新冠病毒的杀伤效率；图10为不同时间下DC疫苗联合CIK细胞对新冠病毒的杀伤效率。具体实施方式实施例1、S蛋白抗原表达载体的构建S蛋白抗原质粒构建各模块核酸序列如下：（1）导引子LeaderCD8(SEQIDNO.1）（2）2019nCOV-S(SEQIDNO.2)（3）T2A(SEQIDNO.3)（4）CCL19(SEQIDNO.4)委托北京博迈德生物技术有限公司分别按照融合基因CD8-2019nCOV-S（SEQIDNO.5）和CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19（SEQIDNO.6）依次串联合成人工核酸序列，插入腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP，转化到E.coli（TOP10），经测序鉴定正确后，利用Qiagen质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组腺相关病毒表达载体pAAV-2019nCOV-S和pAAV-2019nCOV-S-CCL19，其质粒浓度高于200ng/ul。实施例2、腺相关病毒的包装与滴度测定①HEK293细胞的复苏与传代从液氮罐中取出冻存的HEK293细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到50ml离心管中，并在其中加上5ml新鲜的完全培养基（含10%FBS），混匀后离心，1500rpm，5min。去掉上清，加入1ml新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀后，转入T75瓶中，每个瓶中补足到10m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，其特征在于：所述DC疫苗，包括COVID-19的S蛋白、趋化因子CCL19。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，其特征在于：所述DC疫苗，包括COVID-19的S蛋白、趋化因子CCL19。


2.根据权利要求1所述的一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，其特征在于：所述COVID-19的S蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示；所述CCL19的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示。


3.根据权利要求1所述的一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，其特征在于：所述DC疫苗，包括融合基因片段CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19。


4.根据权利要求3所述的一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，其特征在于：所述CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19的核苷酸序列为SEQIDNO.6所示。


5.一种针对新型冠状病毒的DC疫苗的制备方法，其特征在于：所述制备方法，包括S蛋白抗原表达载体的构建、腺相关病毒的包装、感染DC细胞。


6.根据权利要求5所述的一种针对新型冠状病毒的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明录，冯建海，王亮，王立新，强邦明，韩庆梅，金海锋，张传鹏，许淼，
申请(专利权)人：山东兴瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37