将危险分层次的方法与组合物技术

本发明专利技术提供同时测定一种细胞中多个蛋白质的活化状态的方法。此方法可以根据活化状态快速检测复杂细胞群的异质性，与鉴定显示细胞群活化的相关改变的细胞亚组。此外，此方法可以使细胞活性或特性相关联。另外，利用细胞活化的增强剂可以特征鉴定这种途径与细胞群。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及采用流式细胞术检测蛋白质的领域。更具体地说，本专利技术涉及采用多色流式细胞术(polychromatic flow cytometry)鉴定信号转导事件与细胞活化状况。本专利技术还涉及利用增强剂来影响活化状态进一步特征鉴定信号转导事件与活化状况。
技术介绍
蛋白质是细胞的主要组分，蛋白质的时空表达模式与亚细胞定位确定了细胞的形状、结构与功能。许多蛋白质受动态调节，因而它们的活性在对内部或外来信号(cue)的反应中发生改变，这些信号在本文称为“活化事件”。这种调节通常发生在一般称为信号转导级联反应的蛋白质-蛋白质相互作用网络中。级联反应的各成员往往处在活化或非活化状态，这些状态之间的转换导致经由级联反应的信号传播或抑制。鉴于级联反应在细胞发育和功能中具有整体作用，它们的调节异常可导致许多疾病，特别是涉及细胞不适当增殖的那些疾病，例如癌症。研究信号转导的人员常规采用依赖细胞群裂解物的方法，例如western印迹。这种方法本身具有局限性可能混淆关键信息。例如，利用细胞群产生的裂解物使稀少细胞事件被稀释而致其关键活化状况不再明显这种可能性将增加。此外，利用裂解物只能得到信号级联反应时天然细胞活化的大致状况，因为裂解本身改变了级联反应环境。由于这种局限性，需要能关注天然环境中信号转导级联反应各成员的新方法来更好地了解活化状况在疾病中的作用。因此，本专利技术提供同时测定一种细胞中多种蛋白质活化状态的方法。此方法可根据活化状态快速检测复杂细胞群的异质性并鉴定细胞群活化时出现相关改变的细胞亚组。此外，此方法能根据信号转导活化状态将细胞活性或特性相关联，包括分类疾病状态。另外，利用细胞活化增强剂可进一步特征鉴定这种(活化)途径和细胞群。专利技术概述在一优选的实施方案中，本专利技术提供检测各细胞或细胞群中至少两种可活化蛋白质活化状态方法。此方法的第一步骤是提供含有两种可活化蛋白质的细胞群。该步骤之后使该细胞群与多个活化状态特异性结合元件相接触。这些活化状态特异性结合元件包括能与第一可活化蛋白质的第一同种型相结合的第一活化状态特异性结合元件和能与第二可活化蛋白质的第一同种型相结合的第二活化状态特异性结合元件中的至少一种。采用流式细胞术检测是否存在这些元件的结合(情况)从而确定该两种蛋白质的活化状态。在其它实施方案中，用不同的标记物标记该两种结合元件。在另一实施方案中，所测试的细胞是原代细胞(primary cell)。在其它实施方案中，可利用第一和第二可活化蛋白质的活化状态信息测定至少一种细胞的细胞状态。在其它实施方案中，所测定的细胞状态是药物敏感性。在其它实施方案中，细胞群先与候选试剂相接触，再与所述结合元件相接触。在其它实施方案中，所述候选试剂的增强剂。在其它实施方案中，所述增强剂是细胞因子。在其它实施方案中，所述增强剂是生长因子。在其它实施方案中，所述至少一种可活化蛋白质的活化状态是磷酸化状态。在其它实施方案中，所述至少一种可活化蛋白质是激酶。在其它实施方案中，所述至少一种可活化蛋白质是胱冬酶(caspase)。在其它实施方案中，本专利技术提供检测细胞群的各细胞中至少一种可活化蛋白质活化状态的方法。该方法的第一步骤是提供含有第一可活化蛋白质的细胞群。下一步骤包括使该细胞群与多种底物相接触，该多种底物至少包括一种可被可活化蛋白质修饰的底物。然后采用流式细胞术检测受修饰的底物量来检测可活化蛋白质的活化状态。在其它实施方案中，本专利技术提供采用流式细胞术同时检测一种细胞中多个可活化蛋白质活化状态的方法与组合物。本专利技术也提供筛选能同时调节一种细胞中多个可活化蛋白质活性或活化状态的生物活性制剂的方法与组合物。可利用这些方法与组合物测定某细胞的蛋白质活化状况来预测或诊断疾病状态，监测疾病状态的治疗(情况)。此外，可任选采用本专利技术的方法与组合物来连续检测一种细胞中多个可活化蛋白质的活化状态。此外，可任选采用本专利技术的方法与组合物来检测一种蛋白质的活化状态或调节一种蛋白质的活性或活化状态。本专利技术提供可用于本专利技术方法的多种细胞群、单细胞、细胞裂解物、蛋白质与含有该多种细胞群、单细胞、细胞裂解物、蛋白质的样品。具体地说，本专利技术提供可活化蛋白质与能和某可活化蛋白质的某特定同种型相结合的活化状态特异性抗体。在一方面，将所述活化状态特异性抗体与标记物，优选荧光标记物，更优选FRET标记物相偶联。本专利技术一方面提供检测一种细胞第一与第二可活化蛋白质中至少一种活化状态的方法，该方法包括以下步骤a)提供含有该第一和该第二可活化蛋白质的细胞群；b)使该细胞群与多个活化状态特异性抗体相结合，其中该多个活化状态特异性抗体包括i)至少一种能与该细胞群中该第一可活化蛋白质的相应同种型结合的第一活化状态特异性抗体；和ii)至少一种能与该细胞群中该第二可活化蛋白质的相应同种型结合的第二活化状态特异性抗体；和c)采用流式细胞术检测该细胞群的一种细胞中该第一和第二结合状态特异性抗体的结合(情况)，其中该第一活化状态特异性抗体的结合(情况)表明该第一可活化蛋白质处于具体活化状态，该第二活化状态特异性抗体的结合(情况)表明该第二可活化蛋白质处于具体活化状态。在其它方面，第一可活化蛋白质是一种激酶。在其它方面，第一可活化蛋白质是胱冬酶。在其它方面，第一可活化蛋白质是第一激酶，第二可活化蛋白质是第二激酶。在其它方面，第一激酶的所述同种型也可以是第一磷酸化激酶，第二激酶的所述同种型也可以是第二磷酸化激酶。在另一方面，第一活化位点特异性抗体与第一磷酸化激酶相结合，第二活化位点特异性抗体与第二磷酸化激酶相结合。在其它方面，第一可活化蛋白质是第一胱冬酶，第二可活化蛋白质是第二胱冬酶。在其它方面，第一胱冬酶的所述同种型是第一胱冬酶原的切割产物，第二胱冬酶的所述同种型是第二胱冬酶原的切割产物。在另一方面，多个活化位点特异性抗体包括能和第一胱冬酶的同种型相结合的第一活化位点特异性抗体与能和第二胱冬酶的同种型相结合的第二活化位点特异性抗体。在另一方面，本专利技术提供检测一种细胞中至少一种第一可活化蛋白质活化状态的方法，该方法包括以下步骤a)提供至少含有第一可活化蛋白质的细胞群；b)使该细胞群与多种底物相接触，其中该多种底物包括至少一种能被该细胞群中该第一可活化蛋白质的相应同种型修饰的第一底物；和c)采用流式细胞术检测该细胞群一种细胞中第一底物的修饰(情况)，其中受到修饰(情况)表明第一可活化蛋白质处于具体活化状态。在另一方面，该细胞群还含有第二可活化蛋白质；所述多种底物还包括能被该细胞群中第二可活化蛋白质的相应同种型修饰的第二底物；和步骤c)包括采用流式细胞术检测该细胞群一种细胞中第二底物的修饰(情况)，其中受到修饰(情况)表明第二可活化蛋白质处于具体活化状态。在另一方面，本专利技术提供根据一种细胞中至少一种第一可活化蛋白质的活化状态检测该种细胞蛋白质活化状况的方法，该方法包括以下步骤a)提供至少含有第一可活化蛋白质的细胞群；b)使该细胞群与多种底物相接触，其中该多种底物包括至少一种能被该细胞群中第一可活化蛋白质的相应同种型修饰的至少一种第一底物；c)使该细胞群与多个活化状态特异性抗体相接触，其中该活化状态特异性抗体包括至少一种能与该细胞群中第一可活化蛋白质的相应同种型结合的至少一种第一活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测一种细胞中第一和第二可活化蛋白质中至少一种的活化状态的方法，所述方法包括以下步骤：　　　　ａ）提供包含所述第一和第二可活化蛋白质的一群细胞；　　　　ｂ）使所述细胞群与多个活化状态特异性结合元件接触，其中所述多个活化状态特异性结合元件包括：　　　　ｉ）与所述第一可活化蛋白质的第一同种型结合的第一活化状态特异性结合元件；和　　　　ｉｉ）与所述第二可活化蛋白质的第一同种型结合的第二活化状态特异性结合元件；和　　　　ｃ）采用流式细胞术检测是否存在所述第一和第二结合元件的结合从而测定所述第一和第二可活化蛋白质的活化状态。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：OD佩雷斯，GP诺兰，JM伊瑞斯，
申请(专利权)人：利兰斯坦福青年大学托管委员会，
类型：发明
国别省市：US[美国]