幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽与应用制造技术

本发明专利技术提供了一个来自幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位的中和性Ｂ细胞抗原表位多肽及其鉴定方法，确定了抗幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位单克隆抗体６Ｅ６所对应的抗原表位，并且证实此Ｂ细胞表位为单克隆抗体６Ｅ６所识别的特异性抗原表位；本发明专利技术还提供了包含此Ｂ细胞表位及载体蛋白牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的嵌合表位疫苗及其制备方法，此Ｂ细胞表位具有较强的抗原性。本发明专利技术的Ｂ细胞表位作为活性成分制成的疫苗或药物，可以起到预防或清除幽门螺杆菌感染的作用，在医药领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制药和基因工程领域，特别是涉及来自幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位蛋白的一个中和性B细胞抗原表位多肽及其编码的DNA，以及鉴定此中和性B细胞抗原表位的方法与其在医药生物
的应用。
技术介绍
1982年澳大利亚学者Warren和Marshall首先从人胃粘膜中分离培养出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)，他们的发现使得在过去的20多年中，对于溃疡病的认识和治疗发生了很大的变革。2005年10月3日，诺贝尔奖评审委员会宣布，将2005年度诺贝尔生理学和医学奖授予这两位澳大利亚科学家，以表彰他们发现了幽门螺杆菌(Hp)以及这种细菌在胃炎和胃溃疡等疾病中的作用。研究已证实Hp是慢性胃炎、消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因子，与胃癌的发生密切相关，世界卫生组织已经把Hp列为胃癌的I类致病因子。有效的治疗和根除Hp感染已成为人们关注的焦点。Hp是人类感染率最高的慢性致病菌，流行病学调查显示全世界成年人中有50％携带有该菌，因此要克服该致病菌的危害仅仅被动治疗是难以实现的，与其他传染病一样免疫接种将是预防该菌感染的最有效方法。1991年Czinn et al获得了免疫接种的第一证据。他们把Hp的粗制抗原加上佐剂霍乱毒素(CT)经口服途径免疫小鼠，实验组比对照组产生高得多的局部粘膜IgA反应。随着研究的深入，人们所利用的Hp抗原包括超声粉碎抗原，纯化尿素酶全酶，尿素酶亚单位，纯化的细胞空泡毒素(VacA)，热休克蛋白等，其中尿素酶已证实为一种有效的保护性抗原而成为疫苗的首选抗原。Hp尿素酶是Hp的最主要的抗原成份，它能够刺激机体产生强烈的免疫反应。免疫佐剂CT或大肠杆菌毒素能够引起局部粘膜免疫反应以提高免疫保护效果。目前尿素酶疫苗预防Hp感染已在许多动物模型上获得成功。目前临床主要采用抗生素多联疗法治疗Hp感染，虽然可以达到85％的根除率，但存在以下缺点1、药物疗法毒副作用大；2、复杂的联合用药导致病人的依从性差；3、药物不能防止Hp的再感染；4、抗生素治疗易产生耐药性而导致治疗失败；5、对发展中国家病人而言，药物疗法在经济上也较困难。免疫接种是预防和控制感染性疾病最经济而有效的方法，鉴于Hp感染的高发病率及其与慢性胃炎、消化性溃疡以及胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的密切关系，如何通过免疫接种达到防治这些疾病的目的，一直是各国科研人员研究的重点问题。疫苗接种通过有效地调动机体的免疫系统，克服细菌对宿主的免疫逃避来达到预防感染和消除已感染细菌的目的，经济而简便，可在人群中大规模运用，并且对耐药细菌仍然有效，因此研究幽门螺杆菌疫苗具有重要的意义。动物实验研究表明，疫苗接种可以减少Hp在胃粘模定植，并减轻胃粘膜的炎症反应，起到预防和治疗Hp感染的作用。目前关于Hp的疫苗研究多是采用全菌疫苗或重组亚单位疫苗及核酸疫苗等，其引发的免疫应答与Hp自然感染时的免疫应答相似。Hp自然感染时体内产生强烈的细胞与体液免疫应答，但是感染仍慢性持续化甚至终身感染，说明机体已经对Hp存在免疫耐受，自然感染时产生的免疫应答不能起到保护作用，因而通过疫苗接种的方式清除Hp就必须在抗原选择以及表位水平对抗原进行改造，激发更有效的免疫应答。表位疫苗是近年随分子生物学及免疫学的进展而发展起来的一种新的疫苗形式，可以诱导机体产生特异性的免疫应答，并且其具有低变应原性、生产成本低、副作用轻微、安全性好，是目前疫苗研究的一个新的方向，广泛应用于病毒、肿瘤、及慢性感染性疾病的免疫预防和治疗。并且目前很多多肽疫苗倾向于与T细胞或B细胞表位交联，从而构建一个嵌合表位疫苗而发挥作用。借鉴表位疫苗在其它慢性感染性疾病中的研究成果，以Hp表位为基础设计的疫苗有可能打破机体的免疫耐受，达到预防和治疗Hp感染的目的。尿素酶(Urease)是Hp的主要致病因子，对Hp在人胃粘膜定居起着重要作用，在胃部的酸性环境中，一般细菌很难存活，但是Hp的尿素酶能够水解尿素而释放氨，在菌体周围形成一层“氨云”保护Hp抵抗胃酸而在胃粘膜定植，并且释放的氨能直接损害胃粘膜。尿素酶在Hp菌体中的含量高，占可溶性蛋白的6％，由A和B两个亚单位组成，其中B亚单位(UreB)为尿素酶活性亚基，在各菌株中相对保守，研究证实UreB具有很强的抗原性，是较好的Hp疫苗的候选抗原。目前关于Hp的表位研究主要是针对尿素酶的B细胞表位开展的，研究发现针对尿素酶B亚单位(UreB)不同表位的单抗可以抑制尿素酶的活性，从而阻断幽门螺杆菌的感染。近些年来，很多学者通过一些生物信息学软件来分析一些蛋白的氨基酸序列，预测其T细胞或B细胞表位，但预测的准确率仅有50％左右，因此建立一种准确有效的筛选B细胞表位的方法显得尤为重要。因此本专利技术从鉴定Hp的尿素酶B亚单位的B细胞表位入手，研究预防和治疗Hp感染的方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位(UreB)中和性B细胞抗原表位多肽。其中上述表位多肽，具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸残基；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有诱导产生幽门螺杆菌尿素酶B亚单位抗原特异性的细胞或体液免疫应答作用的多肽；3)序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸序列所对应的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO2所示。本专利技术中的一较佳实施例中采用的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位中和性B细胞抗原表位多肽，名称为U211-225，来源于幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)上第211-225位氨基酸残基，具有序列表中SEQ ID No1的15个氨基酸残基序列。含有本专利技术表位肽DNA的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本专利技术的内容。扩增本专利技术表位肽DNA中的引物对也为本专利技术的内容。本专利技术的另外一个目的在于提供一种鉴定上述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽的方法，该方法是通过应用生物信息学软件对Hp的UreB蛋白氨基酸序列进行分析的基础上，经过综合考虑各项参数，选择性的将UreB蛋白分成5段，分别克隆、构建、诱导和表达，通过SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，初步确定抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6所针对的抗原表位所在区域，步移合成法合成4条长度为15个氨基酸的表位多肽，以此获得抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6针对的抗原B细胞抗原表位。上述方法主要包括以下步骤1)将通过生物信息学软件分析的Hp的UreB抗原采用截短法分段构建，将重组表达载体导入宿主细胞进行诱导表达，确定单抗6E6所针对的表位范围；6E6抗体是由本实验室人员制备，其特征如序列表中SEQ ID NO3所示。(1)培养幽门螺杆菌(HPNCTC11637)，并抽提其基因组；(2)DNASTAR软件分析UreB蛋白氨基酸序列，分段构建UreB重组抗原，并分别命名为U12，U13，U47，U15，U16；(3)克隆幽门螺杆菌NCTC11637的U12，U13，U47，U15，U16的编码基因；(4)构建U12，U13，U47，U15，U16基因的原核细胞表达质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）中和性Ｂ细胞抗原表位多肽，其特征在于具有下述氨基酸残基序列之一：１）序列表中的ＳＥＱＩＤＮＯ：１的氨基酸残基；２）将序列表中ＳＥＱＩＤＮＯ：１的氨基酸残基经过一个或数个 氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有诱导产生幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位抗原特异性的细胞或体液免疫应答作用的多肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毛旭虎，邹全明，李海侠，吴亚男，石云，罗萍，张卫军，余抒，陈洪章，郭刚，童文德，吴超，周维英，鲁东水，刘开云，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]