方法和手段技术

本发明专利技术涉及用于刺激吞噬作用（特别是凋亡细胞的吞噬）的方法和手段，并且公开了ａｐｏＥ基因的蛋白质产物（载脂蛋白Ｅ）作为凋亡细胞清除的调控物的作用。ＡｐｏＥ模拟物及刺激凋亡细胞清除的其他化合物可用于治疗一系列病状。本发明专利技术的一个方面提供了鉴定和／或获得用于在个体中治疗与内源性ａｐｏＥ活性降低相关的疾病的化合物的方法，所述方法包括：测定在测试化合物存在时巨噬细胞对凋亡细胞的摄入。相对于在测试化合物不存在时，在测试化合物存在时凋亡细胞摄入增加可以表明，所述化合物可用于治疗与内源性ａｐｏＥ活性降低相关的病状。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于刺激吞噬作用(特别是凋亡细胞的吞噬)的方法和手段。载脂蛋白E(apoE)与载脂蛋白B一起构成了在富含甘油三酯的脂蛋白颗粒LDL和VLDL中存在的蛋白质的大部分。apoE组分是LDL受体(LDLR)和LDL受体相关蛋白(LRP)家族的配体。小鼠中apoE基因的纯合缺失对胆固醇转运有显著的影响，由于无法进行由LDLR和LRP介导的从血液中清除这些脂蛋白而导致LDL和VLDL血浆水平的大大增加。apoE缺陷型小鼠最明显的表型是类似早期人动脉粥样硬化的血管脂质病变的发展，甚至是发生在饮食中具有正常脂肪含量的情况下。apoE基因的三种常见的等位基因变体存在于人中，称为apoε2、ε3和ε4，它们分别编码apoE2、E3和E4。ApoE2和E4各自由于单个氨基酸取代而与最常见的E3同种型不同。与野生型apoε3纯合子相比，甚至单个拷贝的apoε4等位基因的存在也导致冠心病的风险增加。apoε2等位基因与脂蛋白代谢中复杂的缺陷(如III型高脂蛋白血症)相关，并且依靠研究设计，已经与动脉粥样硬化的增加和降低相关联。apoE基因型和心血管疾病发病率之间的关联性的确切分子基础仍未明确。apoε4等位基因的存在已经与阿尔茨海默病的风险增加和骨质疏松症的风险增加相关联。实际上，apoE单倍型和一系列流行的病症之间的关联足够强，以至于apoE仍旧是已经明确与寿命相关的几个基因座之一apoε2等位基因在八十多岁的人中过量表达暗示apoE基因型有助于长寿。ApoE也可能通过不依赖于脂蛋白转运的受体介导的信号传导级联反应来调控局部炎症。例如，apoE以及一种不结合胆固醇的14个氨基酸的受体结合肽能抑制对于体内实验性脑缺血的局部炎症反应。细胞培养研究暗示，这种效果可以通过巨噬细胞功能的抑制来介导。在apoE缺陷型小鼠中慢性感染的研究得到了相似的结论，即apoE以某种方式抑制巨噬细胞的功能。本专利技术人已经发现了apoE基因的蛋白质产物(载脂蛋白E)的一种迄今未为人知的作用，即作为凋亡细胞清除的调控物。ApoE模拟物及刺激凋亡细胞清除的其他化合物可用于治疗一系列病症。本专利技术的一个方面提供了鉴定和/或获得化合物的方法，所述化合物用于在个体中治疗与内源性apoE活性降低相关的病状，所述方法包括测定在测试化合物存在时巨噬细胞对凋亡细胞的摄入。可以将在所述测试化合物存在时巨噬细胞对凋亡细胞的摄入与在测试化合物不存在时在相当的反应培养基和条件下的摄入相比较。相对于在测试化合物不存在时，在测试化合物存在时凋亡细胞摄入增加可以表明，所述化合物可用于治疗与内源性apoE活性降低相关的病状。在一些实施方案中，可在测定凋亡细胞摄入前将巨噬细胞暴露于测试化合物。与内源性apoE活性降低相关的病状可以是遗传起源的(例如，存在一个或多个apoE4等位基因)、环境起源的(例如，由暴露于高水平的胆固醇的细胞所产生的apoE减少)，或可以是选自以下的疾病状况阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、中风和骨质疏松症。在一些实施方案中，可在ApoE存在时测定摄入。例如，可以在ApoE水平正常的条件下实施方法，例如通过在含有生理水平的ApoE的缓冲液中使用野生型巨噬细胞和凋亡细胞(其中存在ApoE)。在这样的实施方案中，可以鉴定出是ApoE激动剂并相对于正常条件增加吞噬速率的测试化合物。在一些实施方案中，方法可以包括将巨噬细胞暴露于测试化合物并将所述巨噬细胞与凋亡多肽接触的步骤。在其他实施方案中，方法可以在apoE不存在时进行，例如通过在无ApoE的条件下(例如使用不含任何apoE的培养基和缓冲液)使用ApoE缺陷型巨噬细胞和凋亡细胞(例如来源于apoE缺陷型小鼠的细胞)进行。在这样的实施方案中，可以鉴定出重现apoE刺激凋亡细胞吞噬的功能的测试化合物。方法可以包括测定在测试化合物存在时在无ApoE的条件下ApoE缺陷型巨噬细胞对ApoE缺陷型凋亡细胞的摄入。在此显示出减少的凋亡细胞清除，导致明显的促炎症表型。在此描述的方法可用于鉴定具有抗炎性质的化合物。合适的化合物刺激凋亡细胞清除、减少募集如此多的巨噬细胞至发炎组织的需要、减少由所述吞噬细胞产生炎症介质并因而导致全身性的抗炎作用。因此，在此描述的方法可用于鉴定治疗剂，所述治疗剂可用于广泛的具有炎性组分的疾病，即使这样的疾病并不是明确地与apoE功能降低或对细胞碎片清除的需求增加相关。本专利技术的另一个方面提供了鉴定和/或获得用于治疗或预防与炎性活性增加相关的病状的化合物的方法测定在测试化合物存在时ApoE多肽刺激巨噬细胞摄入凋亡细胞的能力。可将ApoE多肽在所述测试化合物存在时对于巨噬细胞摄入或吞噬凋亡细胞的刺激与在测试化合物不存在时在相当的反应培养基和条件下的摄入相比较。相对于在测试化合物不存在时，在测试化合物存在时凋亡细胞摄入增加可以表明，所述化合物可用于治疗与炎性活性增加相关的病状。ApoE多肽可以是来自任何哺乳动物物种的ApoE多肽，例如小鼠ApoE或人ApoE(例如人ApoE2、ApoE3或ApoE4)，或可以是其片段或变体，所述片段或变体保留了野生型蛋白的一种或多种活性，特别是对于凋亡细胞吞噬的刺激。例如，ApoE多肽可以含有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与人ApoE3具有大于约30％、大于约40％、大于约45％、大于约55％、大于约65％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、大于约95％的序列同一性。所述序列可以与人ApoE3具有大于约30％的相似性、大于约40％的相似性、大于约50％的相似性、大于约60％的相似性、大于约70％的相似性、大于约80％的相似性或大于约90％的相似性。序列相似性和同一性通常是参考算法GAP(Genetics ComputerGroup，Madison，WI)来定义的。GAP使用Needleman和Wunsch算法来比对两个完整序列，所述算法使得匹配的数目最大化并使得缺口的数目最小化。通常，使用默认参数，缺口形成罚分(gap creationpenalty)＝12和缺口延伸罚分(gap extension penalty)＝4。可以优选使用GAP，但也可以使用其他算法，例如BLAST(其使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215405-410的方法)、FASTA(其使用Pearson和Lipman(1988)PNAS USA 852444-2448的方法)或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.Mol Biol.147195-197)或Altschul等人(1990，同前)的TBLASTN程序，通常采用默认参数。特别是，可以使用psi-Blast算法(Nucl.Acids Res.(1997)25 3389-3402)。序列同一性和相似性也可以用GenomequestTM软件(Gene-IT，Worcester MA USA)来测定。序列比较优选在本文描述的全长相关序列上进行。相似性允许“保守变化”，即一个疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸被置换成另一个疏水性残基，或一个极性残基被置换成另一个极性残基，例如精氨酸置换为赖氨酸、谷氨酸置换为天冬氨酸或者谷氨酰胺置换为天冬酰胺。在一些本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴定和／或获得化合物的方法，所述化合物用于在个体中治疗与内源性ａｐｏＥ活性降低相关的病状，所述方法包括：　　　　测定在测试化合物存在时巨噬细胞对凋亡细胞的摄入。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D格兰杰，
申请(专利权)人：剑桥企业有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]