带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及新型ＨＩＶ蛋白酶切割模型的体系构成、制备方法及应用。本发明专利技术公开一种重组的带有进化免疫球蛋白结合分子的ＨＩＶ蛋白酶底物分子，它是ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１所示的氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白。本发明专利技术还公开了上述蛋白的制备方法及应用。本发明专利技术还公开了展示上述蛋白的噬菌体、其制备方法及应用。本发明专利技术公开的ＨＩＶ蛋白酶切割模型具有简便快速的特点，可用于ＨＩＶ蛋白酶活性鉴定，ＨＩＶ蛋白酶对蛋白酶抑制剂类药物敏感性的鉴定以及ＨＩＶ蛋白酶抑制剂类药物的筛选与鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及HIV蛋白酶底物分子、其制备方法及应用，尤其涉及重组的带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子、其制备方法及应用。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS)，现已成为世界范围内危害人类健康最严重的传染性疾病。人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)蛋白酶包含99个氨基酸，活性形式为同源二聚体。该酶通过切割HIV gag与gag-pol融合蛋白促进病毒颗粒的成熟。Gag蛋白的切割引起病毒体形态的改变以及核心蛋白的浓缩，切割产物与病毒体结构形成及RNA包装密切相关。蛋白酶被包装进病毒体及切割事件基本上与病毒从感染细胞表面出芽同时发生，或稍迟一些完成。缺少活性蛋白酶的原病毒DNA只能产生无感染性的幼稚型病毒颗粒。因此，蛋白酶是HIV复制所必需的酶，也是抗HIV药物的重要靶位点之一。HIV蛋白酶属于天冬氨酸酶类。两个蛋白酶单体形成可转动C2精确对称结构的二聚体。活性中心具有催化活性的Asp基团位于二聚体裂缝底部的共面结构上，通常作用于Gag与Gag-Pol中的保守的氨基酸序列Ser-Thr-Xa-Ya-Phe/Pro-Za。其它的切点位于Phe与Tyl之间也可位于Met-Met，Phe-Leu，Leu-Ala，Leu-Phe之间。现有的抗HIV蛋白酶抑制剂药物是根据蛋白酶的结构设计的一系列HIV蛋白酶切割位点P1-P1’相似物，通过现有的蛋白酶抑制剂药物体外筛选方法从中初筛出有效的抑制物，酶动力学实验分析蛋白酶抑制剂对蛋白酶切割活性的抑制作用，上述大规模体外筛选所获的候选物再用细胞模型进行鉴定，用于抗-HIV新药的开发。与众多HIV反转录酶抑制剂药物相比，目前仅有四个蛋白酶抑制剂药物投入临床应用，Indinavir(Crixivan)，nelfinavir(Viracept)，ritonavir(Norvir)，and saquinavir(Invirase and Fortovase)，这些药物都是通过模拟肽链结合到酶的底物结合部位而抑制蛋白酶的切割作用。由于HIV在逆转录中具有高突变与频繁重组的特性，导致病毒的核苷酸序列呈多样性。HIV-1分为M、N和O组，仅M组又可为A到K的11个亚型。HIV-2则分为A到F六组。并且，各组及亚型均有突变株出现。并且，不仅同一感染个体不同时段体内的HIV基因序列不同，而且同一感染个体同一时段也存在不同基因序列的病毒。HIV-1与HIV-2编码蛋白酶的Pol基因间有34％的核苷酸差异，同一基因型内不同病毒组间也有10％的差异，同一组中不同毒株间的差异也达3％，而单点核苷酸引起的氨基酸不同就可导致对某抗HIV药物的抵抗。因此，目前所开发的蛋白酶抑制剂种类远远不能满足对所有HIV毒株或大部分HIV毒株的有效抑制，必须建立更多的不同序列蛋白酶的筛选模型筛选出更多的蛋白酶抑制剂以有效覆盖更多的HIV毒株。此外，随着HIV蛋白酶抑制剂类药物的应用，HIV蛋白酶耐药性突变的不断产生已成为抗HIV治疗的重大难题之一。HIV蛋白酶通过突变来逃脱蛋白酶抑制剂的作用，临床上主要的耐药性突变图谱已经被绘制，如，30位Asp突变为Asn可引起对nelfinavir耐受，48位Gly突变与90位Leu突变可以导致saquinavir耐受。Condra et al.曾经报导过用indinavir治疗的病人产生对saquinavir和amprenavir的耐药性，即交互耐药现象，从而使得HIV蛋白酶突变耐药机制更为复杂。总的来说，HIV蛋白酶的突变导致病毒耐药性的产生，但是这是以牺牲病毒蛋白酶的活性为代价的，而此类突变之所以能够保留下来，是因为病毒还在蛋白酶切割位点发生相应突变作为补偿。HIV蛋白酶切割位点有两种酶切位点的形式“经典”的位于p17/p24，p11(蛋白酶)/p51之间以及蛋白酶N端，“非经典”的指其余的酶切位点。不同切割位点，有不同切割速度p2/p7与TF(转位蛋白)/蛋白酶之间的是最快的切割位点，而p7/p1与p1/p6则是最慢的切割位点。在蛋白酶抑制剂的作用下，除蛋白酶发生突变外，蛋白酶所识别并切割的Gag前体蛋白的p7/p1和p1/p6也发生了突变。使用蛋白酶序列46、82位突变的重组HIV-1病毒株，作用于无突变p7/p1和p1/p6切割位点时，相比作用于野生型切割位点，复制率降低68％。引入p7/p1突变位点后，相比蛋白酶突变而p7/p1位点无突变的病毒株，复制率提高了41％。可见同时发生蛋白酶突变和适应性酶切位点突变的病毒株生长状态虽然没有野生型病毒好，但比构建的单纯蛋白酶突变的嵌合病毒突变株好。可见，HIV有很好的机制来逃脱抗HIV药物的打击，病毒耐药毒株的不断出现已是抗HIV药物治疗的重大难题。因此，开发新的抗耐药HIV也成为抗HIV新药开发的重要方向和主要工作，而新的抗耐药HIV的新药筛选模型的研发也成为首当其冲的重要研究工作。由此可见，由于HIV蛋白酶的序列多样性及耐药突变的不断产生，有效的高效抗逆转录病毒疗法(highly active anti-retroviral therapy，HAART)疗法要求针对不同HIV蛋白酶应使用不同蛋白酶抑制剂，同时要求蛋白酶抑制剂类药物的体外大规模筛选模型不仅能够筛选出针对现有各种不同蛋白酶的抑制剂，更要能快速不断地对新出现的耐药突变株蛋白酶作出反应，筛选出针对新突变株蛋白酶的抑制剂。虽然目前所应用的蛋白酶抑制剂类药物的体外大规模筛选方法虽然已有多种，却远远不能很好地满足抗HIV新药开发的要求。具体目前所应用的体外大规模筛选方法按功能主要分为两类(1)竞争结合法(2)功能测定法。竞争结合法为目前所应用的主要的体外筛选方法将现有蛋白酶固相化，加入的待筛选药物与现有对此蛋白酶有效的药物竞争性结合固相化蛋白酶，其中待筛药物可带有检测标记如同位素、生物素、荧光物质等，待充分结合后，洗去游离成分，使用同位素测定法、生物素检测法或光学检测法来判断待筛选药物的结合效果是否优于现有药物。若检测结果为阳性，则说明待筛药物与蛋白酶亲合力高于现有药物，可作进一步鉴定。该法已经用于大规模药物体外筛选，具有筛选效果较好、速度快的特点。其缺点也很明确(1)由于是与现有蛋白酶抑制剂竞争结合位点，因此仅能筛选出已知蛋白酶抑制剂的同类物，对于针对序列不同的不能结合已知蛋白酶抑制剂的蛋白酶及耐药性蛋白酶的药物筛选效果不好。(2)不利于生物大分子及其它类型药物如中药等的筛选。由于生物大分子或其它类型的药物与蛋白酶相互作用的多样性，因此可能存在多种并不影响结合但却影响切割效果的相互作用结果，譬如通过与活性中心外的关键基团发生作用引起蛋白酶切割活性的降低甚至丧失等，这样作用的药物候选物该模型效果也不好。功能测定法Matayosh，E.D.et al早在1990就合成了一种含蛋白酶酶切位点短肽的荧光淬灭分子来作为蛋白酶的底物，即在一端连接荧光基团，另一端连接荧光淬灭基团，使用蛋白酶切割该底物后，荧光基因与淬灭基团分离，发出荧光。当所筛分子对蛋白酶有抑制时，底物不被切割，则不能发出荧光，因此，通过检测荧光强度即可判断所筛药物的活性。目前该法已被实际应用到HIV蛋白酶抑制剂的筛选过程中。另外，国外有学者将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组的带有进化免疫球蛋白结合分子的ＨＩＶ蛋白酶底物分子，其特征在于，它是ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１所示的氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘卫，贾建安，周波，蒋少华，陈秋莉，曹洁，赵平，潘欣，温宗梅，戚中田，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]