酶法检测直胆红素试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种酶法检测直胆红素试剂盒。本发明专利技术的试剂盒通过加入酶的复合促进剂，加速了直接胆红素的反应；选用复合抑制剂，确保了反应的特异性；还添加酶保护剂，提高了试剂的稳定性。本发明专利技术的试剂盒有较好的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物试剂
具体涉及一种酶法检测直胆红素试剂盒。
技术介绍
胆红素是临床上判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标。胆红素总量增高、间接胆红素增高表明溶血性贫血，血型不合输血，恶性疾病，新生儿黄疸等。直接与间接胆红素均增高表明急性黄疸型肝炎，慢性活动性肝炎，肝硬变，中毒性肝炎会导致胆红素总量增高、直接与间接胆红素均增高；胆红素总量增高、直接胆红素增高表明肝内及肝外阻塞性黄疸，胰腺癌，毛细胆管型肝炎及其他胆汁瘀滞综合症。正常血清总胆红素浓度为1.7～17.1μmol/L，其中直接胆红素低于3.4μmol/L。当总胆红素达34μmol/L时，临床上即可发现黄疸；如血清总胆红素超过正常范围而肉眼看不出黄疸，则称为隐性黄疸，黄疸最常见于肝胆疾病，但其他系统疾病也可出现。胆红素(bilirubin)是血红素的代谢产物，主要在肝脏内经结合作用转化、排泄；它在血清中可以用三种形式存在未结合胆红素(BU，即游离胆红素)、结合胆红素(Bc单葡萄糖醛酸Bcm和双葡萄糖醛酸胆红素Bcc之和)以及胆红素(白蛋白共价连接胆红素)。胆红素为一种有效的抗氧化剂，具有捕获氧自由基的能力，能保护脂类和脂蛋白不被氧化。它与人体内其它抗氧化防御系统育协同作用，与白蛋白结合后存在于心室的肌细胞部位，阻止该部位产生氧自由基，可调节心肌细胞的胆红素抗氧化活性，保护心室肌细胞不受氧自由基损害。因此当胆红素浓度降低时，冠心病的危险增加。直接胆红素测定的方法主要有重氮法、酶法和钒酸盐氧化法。重氮试剂法历史最久，目前为止仍应用最广。最流行的有J-G法和M-E法。前者在胆红素与重氮试剂反应后产生的重氮胆红素使之在碱性条件下由红色变成绿色。光谱的转移增加了反应的灵敏度和特异性，在绿色环境中基本不干扰，但是这一改变增加了自动化的难度。因此采用该法往往只好手工操作。M-E法在重氮胆红素生成后直接比色(红色)，手续简单，易于自动化是优点，但特异性差，溶血样品的结果严重受扰。由于重氮法历史悠久，医学上有关胆红素的各种论述均以本法为基础。但是它存在缺陷其一是重氮试剂不稳定，它必须由亚硝酸钠和氨基苯磺酸临时生成，生成后最多只能用2天(一般6小时)；其二是重氮试剂与间胆和直胆的反应特异性不佳，在一定条件下测直胆，一部分间胆参与反应，如果反应时间延长，参与的更多，导致测值的不准确。针对上述两点，人们作过无数的改良，但至今仍无满意的结果。而且该方法的操作繁复、试剂不稳定、反应不专一。另外，化学氧化法，即使用化学氧化法测胆红素的渊源很早，70年代就采用铁氰化钾除滴定法测钙时的胆红素干扰，以后也曾有报道用铁氰化钾法测总胆。但无论国内外也都只停留在方法学的探讨上，而没有实际应用价值。1993年日本学者To-kuda发表钒酸氧化法测血清中胆红素。1998年该试剂盒，经临床应用很快发展了众多用户，并获得好评，认为该方法的线性、特异性与酶法的相关均达到比较理想的水平。胆红素的四吡咯结构具有还原性，从理论上讲各种低分子的无机氧化剂和在一定条件下具有氧化性的各种过渡金属元素都可以氧化胆红素，从而可用于测定胆红素。但必须保证反应的专一性，还要周到地防止氧化反应的早、中、晚期可能出现的干扰和副反应。这类化合物除钒酸和亚硝酸钠外还有过苯甲酸钠、过硫酸钠、乙酸锰(III)、硫酸铜、硫酸铁等。因此发展这类方法还有广阔的空间。这类方法的实用性已经得到证明，但进展不大。从上述的比较来看，酶法测定胆红素具有简单、特异的特点。酶法氧化法较好，线性较宽、精密度高、受干扰较小。1988年Ot-suji报告一种新的测总、直胆酶法，其效果总胆也可以，直胆测定把pH降到3.7，并使用CuSO4作酶的促进剂，但该法也没有被推广。1990年lhara等报告在新生儿光疗后的直胆测定中，酶法结果比重氮法明显升高。经分析原因是光照后产生的光胆红素酶法可分解，因而测值偏高，而重氮法则不。这种假性升高可能导致临床上鉴别新生儿的生理或病理性黄疸时发生混乱。因而，目前酶法测胆红素技术虽然已能进入临床应用.但还不完善，在直接胆红素的测量过程中存在反应速度过慢，防止间接胆红素的干扰性差，酶的活性下降快等等缺陷。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种加速直接胆红素反应，提高试剂稳定性的酶法检测直胆红素的试剂。本专利技术基于下列原理(1)选用有效的物质加速直接胆红素的反应。其中酶的复合促进剂为HgCl2、十六烷基氯钾氨、TrionX-405(表面活性剂)；(2)增加有效的间接胆红素的抑制剂，确保反应的特异性。可选用的复合抑制剂为氯化钾、还原型辅酶I、铁氰化钾等；(3)为了保证试剂的稳定性，添加了特殊的酶保护剂，甘露醇和Na2CO3本专利技术提供了一种酶法检测直胆红素试剂盒，该试剂盒由下列试剂1和试剂2组成的试剂1缓冲液 10-200mmol/LHgCl210-100mmol/LTriton x-405 0.01-20ml/L 十六烷基氯钾氨20-100mmol/L试剂2Na2CO310-200mmol/LNaHCO310-200mmol/L胆红素氧化酶 2000-4000U/L还原型辅酶I 10-200mmol/LKCl 10-500mmol/L甘露醇10-200mmol/Lproclin3000.01-0.5ml/L铁氰化钾 10-200mmol/L上述试剂中所述的缓冲液为柠檬酸钠-乳酸缓冲液；甘氨酸-盐酸缓冲液；乙酸-乙酸钠缓冲液。制备方法1.先加入80％的去离子水；2.加入不同的试剂溶解于水；3.试剂1与2以3∶1比例混合，调节所需pH值；4.最后加入酶，加入剩余的水。本专利技术的试剂盒检测效果如下柠檬酸钠-乳酸缓冲液；甘氨酸-盐酸缓冲液；乙酸-乙酸钠缓冲液；(1)0.1M HgCl2十六烷基氯钾氨、Triton x-405作为复合激活剂对反应的影响激活剂对反应的影响 (2)抑制剂对反应的影响0.1M的氯化钾、还原型辅酶I、铁氰化钾作为复合抑制剂抑制直接胆红素抑制剂对反应的影响 (3)不同酶保护剂对胆红素氧化酶的影响加入0.1M的甘露醇和Na2CO3对酶的保护作用 上述检测结果表明本专利技术的试剂盒对胆红素氧化酶有很强的保护作用，随着时间的推移，对酶的保护作用会更明显，12个月后加保护剂的试剂跟没加保护剂的试剂相比，残存酶活率升高57％。附图说明图1为临床相关比较。纵座标为重氮法，横座标为酶法。具体实施例方式实例1试剂1柠檬酸钠300mmol/L乳酸50mmol/LHgCl250mmol/LTriton x-4055ml/L十六烷基氯钾氨 50mmol/L试剂2Na2CO3200mmol/LNaHCO3200mmol/L胆红素氧化酶4000U/L还原型辅酶I 100mmol/LKCl 20mmol/L 甘露醇20mmol/Lproclin3000.3ml/L铁氰化钾 50mmol/L本实例试剂盒作了临床相关性比较取30例不同浓度的临床样本用3种方法平行进行检测3种方法试验结果 实例2试剂1甘氨酸100mmol/L盐酸 50mmol/LHgCl2 50mmol/LTriton x-405 5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法检测直胆红素试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂１和试剂２组成：试剂１：缓冲液１０－２００ｍｍｏｌ／ＬＨｇＣｌ↓［２］１０－１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｔｏｎｘ－４０５０．０１－２０ｍｌ／Ｌ十六烷基氯钾氨２０－１００ｍｍｏｌ／Ｌ试剂２：Ｎａ↓［２］ＣＯ↓［３］１０－２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＨＣＯ↓［３］１０－２００ｍｍｏｌ／Ｌ胆红素氧化酶２０００－４０００Ｕ／Ｌ还原型辅酶Ⅰ１０－２００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ１０－５００ｍｍｏｌ／Ｌ甘露醇１０－２００ｍｍｏｌ／Ｌｐｒｏｃｌｉｎ３０００．０１－０．５ｍｌ／Ｌ铁氰化钾１０－２００ｍｍｏｌ／Ｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：景晟，
申请(专利权)人：上海复星医药集团股份有限公司，上海复星长征医学科学有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]