一种氧化石墨烯磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其制备方法和在细胞分选中的应用技术

本发明专利技术提供了一种氧化石墨烯磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其制备方法和在细胞分选中的应用，属于材料学与生物学交叉技术领域，所述氧化石墨烯磁珠，包括氮化铁磁珠核心和包覆在所述氮化铁磁珠核心表面的石墨烯壳层，所述石墨烯壳层经过插层氧化修饰。本发明专利技术所述氧化石墨烯磁珠对石墨烯外壳进行氧化修饰，不需要额外包覆其他材料即可实现抗体偶联，因而没有外包材料阻碍磁响应性，最大限度的利用氮化铁磁珠的性质，进行磁性分离；偶联CD3抗体的免疫磁珠能够实现T细胞的分选，且可刺激所分离T细胞的增殖。所述氧化石墨烯磁珠的石墨烯外壳含有大量含氧基团，亲水性使其便于在水中分散，能够与细胞充分接触，提高细胞回收率。

【技术实现步骤摘要】
一种氧化石墨烯磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其制备方法和在细胞分选中的应用
本专利技术属于材料学与生物学交叉
，尤其涉及一种氧化石墨烯磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其制备方法和在细胞分选中的应用。
技术介绍
细胞分选是一种从多细胞样品中分离出目的细胞的技术，在多个领域的研究中被广泛应用，包括细胞基本的生物学研究、疾病的诊断以及细胞治疗等诸多领域。科研工作中对单一一种细胞展开研究的需求推动了细胞分选方法的发展，其中与人体免疫系统息息相关的T淋巴细胞一直是医学研究和疾病治疗的关键。无论研究T淋巴细胞作用机制，还是推进以免疫细胞治疗肿瘤为热点的临床应用，均需要从全血或其他混合样本中将T淋巴细胞分离出来，并激活使其扩增。目前的细胞分选方法大致可分为两类，一类是物理筛选法，包括密度离心分选和孔筛分选等，物理筛选法相对简单快捷，但只能将密度或者大小差别很大的细胞分开，密度或者大小相近的细胞无法分离。如从全血中可以通过密度离心法初步得到密度在1.077的单个核细胞。另一类是免疫筛选法，包括流式细胞术分选和免疫磁珠分选，免疫筛选法较物理分选方法具有精确度高、回收率高等优点。其中，流式分选必须依赖有分选功能的流式细胞仪，这种大型仪器价格昂贵，操作复杂。而且细胞经过标记后，通过仪器内部微管，接受光学激发，会受到一定损伤，在应用上有局限性。免疫磁珠分选是用免疫磁珠在混合细胞中捕获特定细胞的方法，免疫磁珠即偶联抗体的磁性颗粒。磁珠上偶联的特异性抗体可以精确识别相应的靶细胞并与之稳定结合，之后在外加磁场下，细胞因与磁珠相连而聚集于磁极周围或滞留在磁力架上的试管中，从而达到分离目的。这种方法具有方便快捷、操作简便、不需要使用大型仪器，具有对细胞的影响较小，分选后的细胞生物活性好等优点，在生物医学领域中应用越来越广泛。目前，市售的免疫磁珠是以Fe2O3、Fe3O4这类铁氧化合物或金属微粒作为内核，外壳采用硅化物或高分子材料，便于在这些外壳上引入功能基团。氮化铁磁性材料的磁响应性远大于氧化铁材料，而目前未见其在生物医学上应用。在中国专利ZL201611150118.2(CN106683813B)公开了一种具有核壳结构的石墨烯包覆磁性复合材料，壳体由多层石墨烯片组成，核芯为氮化铁磁性颗粒。在中国专利ZL201710059934.6(CN106710762B)中公开了在石墨烯磁珠表面包覆二氧化硅的方法，额外包覆SiO2使磁珠粒径趋于统一，但改变了原有的石墨烯外壳性质。同时额外包覆使磁珠粒径增大，一定程度上影响了磁响应性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种氧化石墨烯包覆的氮化铁磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其制备方法和在细胞分选中的应用；所述氧化石墨烯磁珠是对石墨烯外壳进行氧化修饰，氧化后不需要包覆其他材料即可实现抗体偶联，因而没有外包材料阻碍磁响应性，最大限度的利用氮化铁性质，进行细胞的高效分离。所述氧化石墨烯磁珠的石墨烯外壳含有大量含氧基团，亲水性使其便于在水中分散，能够与细胞充分接触，提高细胞回收率。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种氧化石墨烯磁珠，包括氮化铁磁珠核心和包覆在所述氮化铁磁珠核心表面的石墨烯壳层，所述石墨烯壳层经过插层氧化修饰。优选的，所述氧化石墨烯磁珠的粒径为500nm～2μm。本专利技术提供了所述的氧化石墨烯磁珠的制备方法，包括以下步骤：1)将石墨烯包覆的氮化铁磁珠、硝酸钠、硫酸和高锰酸钾混合获得第一混合料液；2)将所述第一混合料液超声分散后，与水混合获得第二混合料液；3)将所述第二混合料液进行插层氧化获得氧化石墨烯磁珠；所述插层氧化的温度为80～90℃，所述插层氧化的时间为3～8min。优选的，步骤2)中所述超声分散的温度为30～40℃，所述超声分散的时间为25～35min。优选的，步骤3)中所述插层氧化后还包括离心、水洗和烘干步骤。优选的，所述离心的转速为7000～8000rpm，所述离心的时间为8～12min。优选的，对所述方法制备的石墨烯磁珠进行均质处理，减少磁珠团聚。本专利技术提供了一种抗体偶联氧化石墨烯磁珠，在所述氧化石墨烯磁珠的石墨烯壳层偶联CD3抗体，包括以下步骤：1)磁珠表面氧化石墨烯上的羧基活化，所述活化温度为15～25℃，所述活化时间为12～18min；2)活化后的磁珠与CD3抗体偶联，所述偶联温度为15～25℃，所述偶联时间为2～4h；步骤1)中所述羧基活化剂为EDC和NHS，所述活化剂加入质量比为EDC：NHS＝3:4。本专利技术提供了所述的抗体偶联氧化石墨烯磁珠在细胞分选中的应用。优选的，将所述抗体偶联氧化石墨烯磁珠与待分选的细胞混合后进行磁分离，收集磁珠、洗涤，洗涤液中即包括T细胞。优选的，所述待分选的混合细胞的浓度为107～108cell/mL，混合细胞、磁珠共孵育时间为8～12min；置于磁极上磁分离时间为8～12min；洗涤2～4次，每次洗涤时间为3～7min。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种氧化石墨烯磁珠，通过对石墨烯壳层的氧化，减少外包覆材料对核心磁响应性的阻碍，最大限度的利用氮化铁核心的性质，能够进行T细胞的高效分离；分选后的T细胞为正常的成团生长的形态，细胞活性不受影响。附图说明图1为氧化石墨烯磁珠均质后的效果及测得的平均粒径，其中左图为氧化石墨烯磁珠照片，右图为平均粒径数据；图2为本专利技术提供的氧化石墨烯磁珠与市售氧化石墨烯的红外光谱图对比；图3为本专利技术提供的氧化石墨烯磁珠的TEM图片，为两个视野下的磁珠，均可见磁珠壳核结构；图4为TMB显色应用酶标仪检测的吸光度数值，可见磁珠组的数值明显高于空白组，与抗体对照组数值相近；图5为偶联绿色荧光抗体的氧化石墨烯磁珠(未做均质处理)在共聚焦显微镜下照片，放大倍数为左:10X，右:60X，表面均可见绿色荧光；图6为抗体偶联氧化石墨烯磁珠分选MT-4细胞(CD3表达34％)及细胞增殖的显微图，从左至右分别为分选当天、培养1天的细胞形态，可见细胞聚团增殖；图7为应用BCA蛋白定量得到的标准曲线；图8为检测偶联CD3抗体后抗体活性时酶标仪检测的吸光度数值，可见100倍稀释后磁珠组吸光度值高于空白组；图9为磁珠分选出MT-4细胞从左至右增殖及形态变化，期间通过磁分离逐渐除去其中磁珠，从左至右分别为分选当天、培养3天、培养5天的细胞形态，可见细胞正常增殖。具体实施方式本专利技术提供了一种氧化石墨烯磁珠，包括氮化铁磁珠核心和包覆在所述氮化铁磁珠核心表面的石墨烯壳层，所述石墨烯壳层经过插层氧化修饰。在本专利技术中，所述氧化石墨烯磁珠的粒径优选为500nm～2μm，更优选为1μm。本专利技术还提供了所述的氧化石墨烯磁珠的制备方法，包括以下步骤：1)将石墨烯包覆的氮化铁磁珠、硝酸钠、硫酸和高锰酸钾混合获得第一混合料液；2)将所述第一混合料液超声分散后，与水混合获得第二混合料液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氧化石墨烯磁珠，其特征在于，包括氮化铁磁珠核心和包覆在所述氮化铁磁珠核心表面的石墨烯壳层，所述石墨烯壳层经过插层氧化修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种氧化石墨烯磁珠，其特征在于，包括氮化铁磁珠核心和包覆在所述氮化铁磁珠核心表面的石墨烯壳层，所述石墨烯壳层经过插层氧化修饰。


2.根据权利要求1所述的氧化石墨烯磁珠，其特征在于，所述氧化石墨烯磁珠的粒径为500nm～2μm。


3.权利要求1或2所述的氧化石墨烯磁珠的制备方法，包括以下步骤：
1)将石墨烯包覆的氮化铁磁珠、硝酸钠、硫酸和高锰酸钾混合获得第一混合料液；
2)将所述第一混合料液超声分散后，与水混合获得第二混合料液；
3)将所述第二混合料液进行插层氧化获得氧化石墨烯磁珠；所述插层氧化的温度为80～90℃，所述插层氧化的时间为3～8min。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述超声分散的温度为30～40℃，所述超声分散的时间为25～35min。


5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述插层氧化后还包括离心、水洗和烘干步骤。

【专利技术属性】
技术研发人员：王明连，梁天亚，王群，
申请(专利权)人：宴晶科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11