一种基于镧系金属自发光Au@Tb-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于新型自发光纳米多孔材料Au@Tb‑MOFs的信号增强型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，属于电化学发光传感器领域，首次以自发光纳米多孔材料Au@Tb‑MOFs为电化学发光信号源，利用纳米花聚苯胺‑夹层氧化钒PVO较传统二维片状材料拥有大的比表面积、暴露更多的活性位点增加抗体的固载量，根据不同浓度抗原引起的电化学发光信号强度的不同，实现对人体血清中Aβ的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于镧系金属自发光Au@Tb-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法
本专利技术涉及一种基于镧系金属自发光Au@Tb-MOFs的增强型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用。具体涉及自发光标记纳米材料Au@Tb-MOFs和基底纳米花聚苯胺-夹层氧化钒（PVO）的制备及其在电致化学发光传感器中的应用。其中PVO花状形貌较单纯二维基底片状材料富含更多的活性位点可负载更多的抗体，金纳米颗粒优良的生物兼容性及自发光Au@Tb-MOFs纳米材料大的比表面积、高的孔隙率达到放大传感器光信号输出及拓宽检测线性范围的目的。本专利技术属于电化学发光检测

技术介绍
从阿尔茨海默症（AD）患者脑内的细胞质基质中分离出来的β-淀粉样蛋白（Aβ）可溶性寡聚物已经被证明可以损害海马突出可塑性、减少突触、诱导tau蛋白过度磷酸化，还会引起神经性营养不良、激活小胶质细胞炎症、损害记忆等症状（在不存在淀粉样斑块的情况下）。AD作为一种进行性不可逆神经系统疾病，严重威胁着人类的健康，大大降低了许多中老年人的生活质量。经过对AD患者大量的科学研究，Aβ由于其具有非常强的神经毒性被认为是AD发病机制的关键，因此被选作诊断AD的生物标志物和治疗靶点。然而寻找一种可以简便快捷灵敏的Aβ检测方法有着重要意义。电化学发光方法消耗低、容易控制、灵敏度高且检测限低，具有电化学和化学发光两种方法的优势，是一种环境友好型方法。因此本专利技术设计了一种信号增强型的电致化学发光免疫分析方法用于早期AD患者脑内细胞质基质Aβ的检测。在本专利技术中，首次使用一种新型自发光纳米多孔材料Au@Tb-MOFs作为标记材料引入到电化学发光领域。一般传统的电致化学发（ECL）会依赖于Ru(bpy)32+、鲁米诺等典型的具有发光性能的发光体，其实验操作需要首先找到适合负载这些发光体的功能材料，如需具有较大的孔隙率、尺寸合适的孔径以及表面是否有可连接的官能团和可进行静电吸附的电荷，并设法将这些功能材料和发光体复合到一起。这样虽然可以达到化学发光的效果，但负载其表面的发光体经常会因为结合力不强或其它外力作用导致脱落，从而输出不确定的检测结果，对传感器的稳定性影响非常大。所以，采用自发光材料来构建化学发光传感器就可以非常有效的避免这一难题。镧系金属元素通常有很强的荧光发射，而且像Tb离子的荧光寿命可长达到1~2ms。经实验证明，基于镧系金属Tb元素合成的Tb-MOFs有着非常强烈的ECL发射行为。此外，将金纳米颗粒修饰到其表面后，也会曾强ECL发射强度。这不仅保障了Au@Tb-MOFs可以输出强且稳定的ECL信号，大大简化了实验步骤，而且还提高了其生物相容性。另外我们利用PVO纳米花作为基底材料，较普通二维片状、球状或n面体材料具有更大的比表面积，可以暴露更多的活性位点来连接Aβ抗体。从而可以更加精准的捕获Aβ，大大的提高ECL免疫传感器的灵敏度。本专利技术的原理是随着捕获Aβ的量的增加，连接到传感器表面的自发光材料Au@Tb-MOFs标记的二抗越多，ECL信号逐渐增强。此外，本专利技术设计的信号增强型免疫传感器也为其它大分子蛋白质分析物的检测提供了一种新方法。目前基于自发光纳米材料Au@Tb-MOFs构建信号增强型ECL免疫传感器来检测Aβ的方法还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种更灵敏准确的基于自发光纳米材料Au@Tb-MOFs的电致化学发光免疫传感器的制备方法和应用，实现对大分子蛋白Aβ的快速、特异、高效检测。本专利技术的技术方案如下：为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1.纳米花聚苯胺-夹层氧化钒PVO标记Aβ第一抗体孵化物的制备、自发光纳米多孔材料Au@Tb-MOFs标记Aβ偶联抗原孵化物溶液的制备（1）纳米花聚苯胺-夹层氧化钒PVO的制备将0.15mg~0.21g五氧化二钒加入至30mL~50mL苯胺中磁力搅拌3min，逐滴加入0.1molL的盐酸溶液调节pH至2~4，超声反应10min，转移至50mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，100℃~140℃反应12h~36h，超纯水和绝对乙醇洗涤数次，50℃真空干燥，得到蓝黑色产物纳米花聚苯胺-夹层氧化钒PVO；将5mg~10mgPVO分散在0.1%~1%、2mL戊二醛溶液中，室温振荡2h，超纯水洗去未反应戊二醛，加入500μL、6mgmL的Aβ第一抗体溶液，4℃恒温震荡2h，用pH7.5的PBS溶液洗去未反应抗体，最后分散在1mLpH7.5的PBS溶液中得到PVO偶联抗体，稀释至不同浓度备用；（2）自发光纳米多孔材料Au@Tb-MOFs的制备将30mg~40mg六水合氯化铽和5mmoL~15mmoL硼酸加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的混合溶液中，磁力搅拌1h~3h，转移至50mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140℃~160℃反应6h~18h，乙醇和超纯水分别洗涤两次，40℃~60℃真空干燥箱干燥12h，即得到白色产物Tb-MOFs，将30mg~50mg纳米多孔Tb-MOFs分散在50mL超纯水中，加入1mL~3mL、1%~3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5min，加入4mg~6mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70mg~90mg还原剂柠檬酸三钠，0.5mg~1mg硼氢化钠，室温下搅拌8h~12h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35℃真空干燥12h，得到紫黑色固体Au@Tb-MOFs；（3）自发光纳米多孔材料Au@Tb-MOFs标记Aβ孵化物溶液的制备将6mg~10mg的Au@Tb-MOFs分散于1mLpH7.5的PBS中，加入4μL~6μL、6mg/mL的Aβ溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h~24h，4℃离心分离洗去未结合的Aβ，然后加入1mL0.1%的牛血清白蛋白溶液4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2h~4h封闭Au@Tb-MOFs表面的非特异性活性位点，4℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5mg/mL~1.5mg/mL的Au@Tb-MOFs标记Aβ溶液，储存于4℃中备用；2.一种基于镧系金属自发光Au@Tb-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）分别用1.0µm、0.3µm、0.05µm的氧化铝抛光粉对直径4mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）将6µL、0.5mg/mL~1.5mg/mLPVO偶联抗体溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；（3）将2μL~4μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；（4）将6μL、一定浓度的Aβ溶液滴加到电极表面，用pH7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；（5）将6μL、0.5mg/mL~1.5mg/mL的Au@Tb-MOFs标记Aβ第二抗体溶液滴加到电极表面，4℃晾干，用pH7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Tb本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于镧系金属自发光Au@Tb-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：/n（1）纳米花聚苯胺-夹层氧化钒PVO的制备/n将0.15 mg ~ 0.21 g五氧化二钒加入至30 mL ~ 50 mL苯胺中磁力搅拌3 min，逐滴加入0.1 mol L的盐酸溶液调节pH至2 ~ 4，超声反应10 min，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，100 ℃ ~ 140 ℃反应12 h ~ 36 h，超纯水和绝对乙醇洗涤数次，50 ℃真空干燥，得到蓝黑色产物纳米花聚苯胺-夹层氧化钒PVO；/n将5 mg ~ 10 mg PVO分散在0.1% ~ 1%、2 mL戊二醛溶液中，室温振荡2 h，超纯水洗去未反应戊二醛，加入500 μL、6 mg mL的Aβ第一抗体溶液，4 ℃恒温震荡2 h，用pH 7.5的PBS溶液洗去未反应抗体，最后分散在1 mLpH 7.5的PBS溶液中得到PVO偶联抗体，稀释至不同浓度备用；/n（2）自发光纳米多孔材料Au@Tb-MOFs的制备/n将30 mg ~ 40 mg六水合氯化铽和5 mmoL ~ 15 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的混合溶液中，磁力搅拌1 h ~ 3 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140 ℃ ~ 160 ℃反应6 h ~ 18 h，乙醇和超纯水分别洗涤两次，40 ℃ ~ 60 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Tb-MOFs，将30 mg ~ 50 mg纳米多孔Tb-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入1 mL ~ 3 mL、1% ~ 3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg ~6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg ~ 90 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg ~ 1 mg硼氢化钠，室温下搅拌8 h ~ 12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Tb-MOFs；/n（3）自发光纳米多孔材料Au@Tb-MOFs标记Aβ孵化物溶液的制备/n将6 mg ~ 10 mg的Au@Tb-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入4 μL ~ 6 μL、6 mg/mL的Aβ溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h ~ 24 h，4 ℃离心分离洗去未结合的Aβ，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h ~ 4 h封闭Au@Tb-MOFs表面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL ~ 1.5 mg/mL的Au@Tb-MOFs标记Aβ溶液，储存于4 ℃中备用；/n（4）分别用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；/n（5）将6 µL、0.5 mg/mL ~ 1.5 mg/mL PVO偶联抗体溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；/n（6）将2 μL ~ 4 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；/n（7）将6 μL、一定浓度的Aβ溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；/n（8）将6 μL、0.5 mg/mL ~ 1.5 mg/mL的Au@Tb-MOFs标记Aβ第二抗体溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Tb-MOFs的信号增强型电致化学发光免疫传感器。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于镧系金属自发光Au@Tb-MOFs的信号增强型免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：
（1）纳米花聚苯胺-夹层氧化钒PVO的制备
将0.15mg~0.21g五氧化二钒加入至30mL~50mL苯胺中磁力搅拌3min，逐滴加入0.1molL的盐酸溶液调节pH至2~4，超声反应10min，转移至50mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，100℃~140℃反应12h~36h，超纯水和绝对乙醇洗涤数次，50℃真空干燥，得到蓝黑色产物纳米花聚苯胺-夹层氧化钒PVO；
将5mg~10mgPVO分散在0.1%~1%、2mL戊二醛溶液中，室温振荡2h，超纯水洗去未反应戊二醛，加入500μL、6mgmL的Aβ第一抗体溶液，4℃恒温震荡2h，用pH7.5的PBS溶液洗去未反应抗体，最后分散在1mLpH7.5的PBS溶液中得到PVO偶联抗体，稀释至不同浓度备用；
（2）自发光纳米多孔材料Au@Tb-MOFs的制备
将30mg~40mg六水合氯化铽和5mmoL~15mmoL硼酸加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的混合溶液中，磁力搅拌1h~3h，转移至50mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140℃~160℃反应6h~18h，乙醇和超纯水分别洗涤两次，40℃~60℃真空干燥箱干燥12h，即得到白色产物Tb-MOFs，将30mg~50mg纳米多孔Tb-MOFs分散在50mL超纯水中，加入1mL~3mL、1%~3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5min，加入4mg~6mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70mg~90mg还原剂柠檬酸三钠，0.5mg~1mg硼氢化钠，室温下搅拌8h~12h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35℃真空干燥12h，得到紫黑色固体Au@Tb-MOFs；
（3）自发光纳米多孔材料Au@Tb-MOFs标记Aβ孵化物溶液的制备
将6mg~10mg的Au@Tb-MOFs分散于1mLpH7.5的PBS中，加入4μL~6μL、6mg/mL的Aβ溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏琴，赵冠辉，杜宇，鞠熀先，匡轩，范大伟，曹伟，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37