ACE基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了ACE基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法，所述引物组包括rs1799752位点的扩增引物对SEQ ID NO.1‑2、插入型锚定引物SEQ ID NO.3和缺失型锚定引物SEQ ID NO.4；其中所述扩增引物包含可断裂位点或可切除序列。本发明专利技术设计两对位点检测锚定引物和特异测序探针实现该位点检测，一组位点测序锚定引物和特异探针检测插入型，一组位点测序锚定引物和特异探针检测缺失型。通过分型两个检测信号来判定检测结果，提高检测准确性，只对目标序列进行测序分析，降低测序结果分析难度。

【技术实现步骤摘要】
ACE基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种ACE基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法，具体涉及一种ACE基因插入/缺失检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
血管紧张素转化酶基因(angiotensinconvertingenzyme，ACE)基因内含子16(rs1799752位点)存在288bp的Alu插入/缺失(I/D)多态性导致三种基因型：II、ID、DD，亚洲人群中D等位基因的频率为39％。ACEI/D多态性可影响ACE的水平，DD基因型个体血浆ACE的活性升高，依那普利治疗后ACE活性下降更明显；在初治的高血压患者中，DD型患者福辛普利的降压疗效增强；在高血压合并左心室肥大患者中，DD基因型患者服用依那普利和赖诺普利后心功能改善程度优于ID和II基因型患者；II基因型患者应用赖诺普利或卡托普利时肾功能下降更明显。ACE基因多态性研究具有重要意义，现有针对ACE基因多态性I/D分型的方法包括Sanger测序、基因芯片杂交法、Taqman荧光探针法、变性高效液相色谱(dHPLC)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)和等位基因特异性扩增法(AmplificationRefractoryMutationSystemRealTimePCR，ARMS-RTPCR)等。Sanger测序法结果准确，但但检测步骤较多、操作繁琐、检测灵敏度较低；基因芯片杂交法的检测步骤较多、操作繁琐、检测灵敏度较低，还会存在假阳性的问题；Taqman荧光探针法，ARMS-RTPCR方法检测通量低。且针对插入/缺失型设计不同的探针难度较大。其他各种方法也均有优劣，例如检测错误信息比例高、灵敏度低、假阳性率高、耗时较长、通量小等问题。CN108690876A公开了一种检测ACE基因多态性的引物、探针及应用、试剂盒和检测方法。包括检测ACE(rs4646994)多态性的引物、探针及其应用。所述引物和探针能在荧光定量PCR平台上有效地检测出插入/缺失突变型的ACE(rs4646994)基因，操作方法简单易行，即降低污染风险，又提高效率，但通量小，面临多样本时处理周期较长。CN108410966A公开了一种用于检测ACE基因插入与缺失的方法，该方法包括以下步骤：步骤S10，在待测试样品中添加具有HEX标记的探针和1对引物进行试剂配制；步骤S20，将试剂进行不等位PCR扩增；步骤S30，借助LC480平台进行溶解曲线，并收集相应的荧光信号。该专利技术的优势在于利用成熟的荧光定量PCR技术，只需1条HEX标记的探针和1对普通引物，先通过普通的不等位PCR，再在多种不同荧光定量PCR仪上运行熔解曲线，只需90分钟左右，即可完成ACE基因多态性II，ID和DD的3种基因分型。CN108018356A公开了一种ACE检测试剂盒及检测方法，包括用于对含rs4646994位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，所述引物组包括上游引物，以及下游引物。该专利技术的试剂盒通过采用特异性扩增引物组对含上述rs4646994位点的核酸片段进行扩增，使得对ACE基因突变的检测灵敏度高、假阳性率低；该专利技术的试剂盒采用第二代高通量基因测序技术进行检测，使得检测周期短，通量高。但二代测序方法涉及序列比对/拼接，比对分析等生物信息学分析步骤，测序后的分析难度较高，存在假阴性/假阳性问题。因此，提供一种灵敏度高、检测周期短、检测通量高、成本低且假阳性率低的用于检测ACE(I/D)多态性的方法具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种ACE基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法，针对ACE基因rs1799752位点插入/缺失基因型灵敏度高、且检测周期短、检测通量高、成本低的检测方法。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种ACE基因插入/缺失检测的引物组，包括rs1799752位点的扩增引物对SEQIDNO.1-2、插入型锚定引物SEQIDNO.3和缺失型锚定引物SEQIDNO.4；其中所述扩增引物包含可断裂位点或可切除序列。扩增引物上游引物序列SEQIDNO.1：5’-ACGGUATGCCTGTAGTCCTAGCTGC-3’.扩增引物下游引物序列SEQIDNO.2：5’-GGATCTACCTTTTCCTAGGCTT-3’.插入型锚定引物SEQIDNO.3：5’-AAAAAAAAAAGTGACTG-3’.缺失型锚定引物SEQIDNO.4:5’-GCTGCCTATACAGTCACTTT-3’.优选地，所述引物组还包括插入型探针SEQIDNO.5和缺失型探针SEQIDNO.6。插入型探针SEQIDNO.5：5’-CTCCGTCTCAAAAA-3’.缺失型探针SEQIDNO.6：5’-TATGTGGTTTCGCCA-3’第二方面，本专利技术提供一种ACE基因插入/缺失检测试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的引物组。优选地，所述试剂盒还包括接头、断裂剂、连接酶和连接酶缓冲液，所述断裂剂对扩增引物的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割。优选地，所述接头上还有标签序列。本专利技术中，为了在同时检测过程中能够区分不同的样本来源，本具体实施例在接头上设计了标签序列，可以由1-14个碱基(A、T、C或G)组成，根据样本的数量进行选择，便于分析检测结果对应的样本来源。优选地，所述接头与经过断裂处理的含有rs1799752位点的扩增产物连接。优选地，所述接头为双链双突出末端接头。本专利技术中，双链双突出末端接头的一端与断裂后的引物匹配连接，另一端有利于和固相载体连接。优选地，所述接头的一条链的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，另一条链的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，具体序列如下所示：SEQIDNO.7：CCTCCCTGCAGTCTCTATGGGCNNNNCTGCTAGTCGCTGAAGTAGTCGGT.SEQIDNO.8：CTACTTCAGCGACTAGCAGNNNNGCCCATAGAGACTGCAGGG.优选地，所述断裂剂包括USER酶。优选地，所述试剂盒还包括标签锚定序列SEQIDNO.9，具体序列如下所示：SEQIDNO.9：GCCCATAGAGACT.第三方面，本专利技术提供一种用于非疾病诊断治疗目的的ACE基因插入/缺失检测方法，使用如第一方面所述的引物组或第二方面所述的试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤：(1)用扩增引物扩增包含ACE基因rs1799752位点的基因片段，扩增产物与接头连接，构建待测文库，并将文库分子可寻址固定在固相载体上，将待测片段变性为单链；(2)加入插入型锚定引物、插入型探针，检测信号，变性去除连接测序产物；(3)加入缺失型锚定引物、缺失型探针，检测信号，变性去除连接测序产物；(4)加入检测接头上标签的锚定引物，加入荧光标记的寡核苷酸探针，进行连接反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ACE基因插入/缺失检测的引物组，其特征在于，包括rs1799752位点的扩增引物对SEQ ID NO.1-2、插入型锚定引物SEQ ID NO.3和缺失型锚定引物SEQ ID NO.4；/n其中所述扩增引物包含可断裂位点或可切除序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种ACE基因插入/缺失检测的引物组，其特征在于，包括rs1799752位点的扩增引物对SEQIDNO.1-2、插入型锚定引物SEQIDNO.3和缺失型锚定引物SEQIDNO.4；
其中所述扩增引物包含可断裂位点或可切除序列。


2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包括插入型探针SEQIDNO.5和缺失型探针SEQIDNO.6。


3.一种ACE基因插入/缺失检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的引物组。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括接头、断裂剂、连接酶和连接酶缓冲液，所述断裂剂对扩增引物的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述接头上还有标签序列；
优选地，所述接头直接与含有rs1799752位点的扩增产物连接。


6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述接头为双链双突出末端接头；
优选地，所述接头其中一条链的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，另一条链的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。


7.根据权利要求4-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述断裂剂包括USER酶；
优选地，所述试剂盒还包括标签锚定序列SEQIDNO.9。


8.一种用于非疾病诊断治疗目的的ACE基因插入/缺失检测方法，其特征在于，使用如权利要求1或2所述的引物组或权利要求3-7任一项所述的试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤：
(1)用扩增引物扩增包含ACE基因rs1799752位点的基因片段，扩增产物与接头连接，构建待测文库，并将文库分子可寻址固定在固相载体上，将待测片段变性为单链；
(2)加入插入型锚定引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：段朝晖，盛司潼，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，深圳华因康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44