基因扩增参考品及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基因扩增参考品及其应用。该方法包括：将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品；基因扩增阳性DNA指仅含有发生基因扩增的靶基因的DNA；分别测定初始扩增阳性参考品和野生型基因组DNA中，靶基因的扩增倍数，并分别记为X和Y，扩增倍数指靶基因的拷贝数与参照基因的拷贝数的比值；将相同DNA质量体积浓度的初始扩增阳性参考品与野生型基因组DNA按1：T的体积比混合，获得扩增倍数为Z的基因扩增参考品，其中Z为满足0<Y<Z<X的任意数值，且T＝S×(X‑Z)/[(1+S)×(Z‑Y)]。该方法具有快速、简单、验证费用低、重现性强的优点。

【技术实现步骤摘要】
基因扩增参考品及其应用
本专利技术涉及参考品领域，具体而言，涉及一种基因扩增参考品及其应用。
技术介绍
在癌症治疗领域，多个基因在其发生基因扩增(geneamplification，指基因拷贝数异常增多)时与癌症靶向治疗药物的疗效密切相关，例如乳腺癌中HER2基因扩增与曲妥珠单抗(一种抗体靶向药物)、肺癌中MET基因扩增与克唑替尼(一种小分子靶向药物)的疗效密切相关。因此基因扩增检测具有重要的临床意义，基因扩增检测技术业已在临床得到应用。在基于核酸水平的基因扩增检测技术和产品的开发及验证过程中，需要对开发的技术和产品的多项分析性能指标进行评估。对于定性检测试剂，评估指标一般包括：精密度、阳性符合率、阴性符合率、分析特异性、最低检测限等，而在评估过程中均需要使用含有靶基因扩增的参考品。这类参考品的特征是：(1)参考品的基因构成特征应尽可能模拟临床样本；(2)靶基因相对于参照基因(参照基因是基因组中未发生基因扩增/缺失的基因)拷贝数具有已知的不同水平的扩增倍数(扩增倍数指的是靶基因相对于参照基因拷贝数的倍数)。具体来说，在精密度评估中，需要同时使用靶基因扩增倍数为低水平、中或高水平的参考品分别进行批内、批间、日内、日间，由不同人、在不同地点、使用不同批次试剂进行反复测试，从而评估检测试剂的精密度(包括重复性、重现性)；在阳性符合率评估中，需要同时使用靶基因扩增倍数为高水平、中水平、低水平的参考品进行测试；在最低检测限评估中，需要同时使用靶基因扩增倍数从高到低的一系列参考品进行测试，将阳性检出率至少为95％的最低扩增倍数作为检测试剂的最低检测限。注：参考品中靶基因扩增倍数处于低、中、高水平，一般情况下分别指的是靶基因扩增倍数为2～6、6～10、10以上。由此可见，基因扩增参考品是基因扩增检测技术和产品开发及分析性能评估过程中最为重要的实验材料和测试工具，旨在确保基因扩增检测技术和产品开发的有效性；基于基因扩增参考品制成的基因扩增标准品或标准物质，也是基因扩增检测结果溯源性的重要保障。目前，获取基因扩增参考品的方式包括外购和自制。外购参考品所面临的困难是：目前国内外鲜有基因扩增参考品/标准品的制造商，且这类参考品/标准品涵盖的基因种类很少、价格非常昂贵，对于一项完善的基因扩增检测技术和产品的分析性能评估而言，需要用到大量的参考品，如果外购参考品完成实验则需要耗费巨资。自制参考品尽管可以涵盖更多的基因种类，且制备成本也比外购大大降低，但依然面临困难：受限于实验者的技术水平和质量意识，有的制备流程过于简单缺乏定量过程，有的制备流程过于复杂导致验证用试剂成本高、周期长，可以说是乱象丛生。在自制基因扩增参考品的过程中，需要设置由高到低的一系列靶基因扩增倍数水平，从而获得一套完整的基因扩增参考品，用于完成不同的分析性能评估项目。由于来自临床样本或细胞系的、靶基因发生扩增的样本可用的量非常有限，难以提供来源稳定、满足源源不断需求的量的参考品，且采用临床样本或细胞系的、靶基因发生扩增的样本配制出的基因扩增参考品中靶基因的扩增倍数，无法超过初始临床样本或细胞系中靶基因的扩增倍数，也给参考品中靶基因扩增倍数的设置带来了局限性。因此，常使用通过分子克隆构建的靶基因质粒、PCR产物、核酸合成基因等方式来获取靶基因DNA，进而配出靶基因扩增参考品。另外，由于参考品应尽可能模拟实际样本的基因构成，而质粒、PCR产物等阳性DNA中虽含有靶基因部分序列但无法涵盖整个基因组，因此常常通过混合阳性DNA与基因组DNA的方式来制备基因扩增参考品。为了得到目标所需的较低扩增倍数的参考品，常规方法是：将靶基因扩增倍数较高的参考品与野生型基因组DNA分别按照不同比例进行混合，再将制备得到的一系列候选参考品一同进行扩增倍数的定量，最后找到扩增倍数符合需求的参考品投入使用。这种常规制备方法面临的困境是：(1)如果在基因扩增参考品的制备过程中缺乏定量过程，那么基因扩增参考品中的靶基因实际扩增倍数可能大大偏离预期，所制备出的参考品无法保证其准确性，从而造成使用这些参考品得到的实验结果失真、实验结果的有效性也就无从谈起。(2)目前对于基因扩增参考品中的靶基因相对于参照基因拷贝数倍数的精确定量，常用数字PCR、高通量测序(NGS)等技术方法实现，每个测定反应的实验周期较长、测试试剂费用较高，因此，在制备基因扩增参考品时，如果按照常规方法先配制出多个梯度作为候选参考品，然后再逐一测定这些候选参考品中的靶基因扩增倍数，则导致参考品配制过程复杂、靶基因扩增倍数定量的样品较多也导致验证过程长、验证费用高，从而大大制约了基因扩增参考品的制备效率。鉴于此，目前亟需提供一种快速、简便、准确的制备基因扩增参考品的方法。特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种基因扩增参考品及其应用，以提供一种快速、简便、准确的制备基因扩增参考品的方法。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种制备基因扩增参考品的方法，该方法包括：将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品；基因扩增阳性DNA指仅含有发生基因扩增的靶基因的DNA；分别测定初始扩增阳性参考品和野生型基因组DNA中，靶基因的扩增倍数，并分别记为X和Y，其中，扩增倍数指靶基因的拷贝数与参照基因的拷贝数的比值；将相同DNA质量体积浓度的初始扩增阳性参考品与野生型基因组DNA按1：T的体积比混合，获得扩增倍数为Z的基因扩增参考品，其中Z为满足0<Y<Z<X的任意数值，且T＝S×(X-Z)/[(1+S)×(Z-Y)]。进一步地，基因扩增阳性DNA通过以下任一方式获得：(1)通过分子克隆技术构建含有靶基因扩增序列的质粒，并提取质粒DNA；(2)通过PCR获得含有靶基因扩增序列的PCR产物，并纯化PCR产物DNA；(3)通过核酸合成的方式获得含有靶基因扩增序列的双链DNA，并纯化DNA。进一步地，将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品包括：根据预期的初始扩增阳性参考品中靶基因的目标扩增倍数，估算基因扩增阳性DNA的质量体积浓度，并配制估算所得质量体积浓度的基因扩增阳性DNA；将估算配制所得的基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品。进一步地，1：S的体积比为1：1～1：10；优选地，若初始扩增阳性参考品中靶基因的扩增倍数X低于目标扩增倍数，方法还包括：调整1：S的体积比以加大基因扩增阳性DNA的比例，并重复测定初始扩增阳性参考品中靶基因的扩增倍数X。进一步地，野生型基因组DNA从细胞系或临床样本中提取得到。进一步地，野生型基因组DNA是组织DNA或细胞游离DNA。进一步地，通过数字PCR或高通量测序的方法分别测定初始扩增阳性参考品和野生型基因组DNA中靶基因的扩增倍数。为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种基因扩增参考品，该基因扩增参考品通过上述任一种方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备基因扩增参考品的方法，其特征在于，所述方法包括：/n将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品；所述基因扩增阳性DNA指仅含有发生基因扩增的靶基因的DNA；/n分别测定所述初始扩增阳性参考品和所述野生型基因组DNA中，所述靶基因的扩增倍数，并分别记为X和Y，其中，所述扩增倍数指所述靶基因的拷贝数与参照基因的拷贝数的比值；/n将相同DNA质量体积浓度的初始扩增阳性参考品与野生型基因组DNA按1：T的体积比混合，获得所述扩增倍数为Z的所述基因扩增参考品，其中Z为满足0<Y<Z<X的任意数值，且T＝S×(X-Z)/[(1+S)×(Z-Y)]。/n

【技术特征摘要】
20200724 CN 20201072433721.一种制备基因扩增参考品的方法，其特征在于，所述方法包括：
将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品；所述基因扩增阳性DNA指仅含有发生基因扩增的靶基因的DNA；
分别测定所述初始扩增阳性参考品和所述野生型基因组DNA中，所述靶基因的扩增倍数，并分别记为X和Y，其中，所述扩增倍数指所述靶基因的拷贝数与参照基因的拷贝数的比值；
将相同DNA质量体积浓度的初始扩增阳性参考品与野生型基因组DNA按1：T的体积比混合，获得所述扩增倍数为Z的所述基因扩增参考品，其中Z为满足0<Y<Z<X的任意数值，且T＝S×(X-Z)/[(1+S)×(Z-Y)]。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因扩增阳性DNA通过以下任一方式获得：
(1)通过分子克隆技术构建含有靶基因扩增序列的质粒，并提取质粒DNA；
(2)通过PCR获得含有靶基因扩增序列的PCR产物，并纯化PCR产物DNA；
(3)通过核酸合成的方式获得含有靶基因扩增序列的双链DNA，并纯化DNA。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品包括：
根据预期的所述初始扩增阳性参考品中所述靶基因的目标扩增倍数，估算所述基因扩增阳性DNA的质量体积浓度，并配制估算所得...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈钊，莫敏俐，李东霞，刘玉忠，刘阳，张艳，
申请(专利权)人：嘉兴雅康博医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33