通过双向电泳同时分离生物分子的方法和仪器技术

本发明专利技术描述一个用于同时且可重复的分离生物分子的双向电泳方法和实现这一方法的仪器。特别是，本发明专利技术涉及上述定义的方法和仪器可以在一个基质上转移和分离已经在另一个基质中基于化学和／或物理特性预整理的蛋白质和／或多肽和／或肽组分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一个双向电泳分离生物分子的方法，特别是包含在生物样 品中的蛋白质和/或多肽和/或肽组分，这是通过应用具有非平行力线的电场 以及合适的仪器来实现的。
技术介绍
如今已经有很多技术用于分离生物分子，特别是蛋白质。事实上，许 多电泳技术(如聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和等电聚焦(isoelectrofocalization))和色谱技术(如离子交换色谱、亲和色谱、凝胶过滤 色谱)都在应用。已知，现在可以同时分离上千蛋白质的最有效的方法就是 双向电泳(2-DPAGE)。该工艺包括-等电聚焦(正F，第一向电泳)，就是根据蛋白质等电点在聚丙烯酰胺基 质上将它们分离；-平衡，这样得到恒定的蛋白质的电荷/质量比；-在十二烷基硫酸钠(SDS)中的聚丙烯酰胺基质电泳(SDS PAGE,第二 向电泳)，在其中蛋白质基于其分子量而分离； -凝胶染色以使点上所含的蛋白质可视化； -加工所得数据； -点取样。后续的样品蛋白质的鉴定通过质谱或其他己知的技术进行分析。 关于这项技术的详细说明参见美国专利4088561。其它有关该技术的 更优化的改进方式参见近期的专利:JP58193446; US4874490; WO 0226773。蛋白质组学的目的是检测细胞中表达的全套蛋白质，而双向电泳技术 是蛋白质组学研究的基础。目标是比较健康细胞与疾病细胞之间蛋白质 组，以确定后者的病理状态，从而促进新的特异性治疗试剂的发展。已知，该项技术在分离生物样品中的不同组分时存在缺陷，这些组分的数量很大；而该技术的首要限制就是分离混合物中数量较小的组分的可 见性问题。这一缺陷产生的原因是存在蛋白质和/或多肽和/或肽具有相似的 分子量(MW)和等电点(pI)，但相对丰度却不同，也就是说，能检测到的含 量不同。这意味着可也识别测试样品的大部分的小可能性以及未充分分离 的单个样品点手工测定量的难度。该技术还有一个缺陷是，当一种蛋白质不能与其他组分充分分离时， 表征和鉴定该蛋白就变得十分困难，也就是说，似乎是包含一个单独蛋白 质分子的斑点通常由具有相似特征的不同蛋白形成。表征并鉴定这些斑点 (其由本领域普通技术人员通过质谱等常规手段进行鉴定)还不可行，或者说 在某些情况下只能鉴定出含量高的蛋白质组分。本专利技术主要的但不是唯一的目的是克服所述的缺陷，从而使显著提高 生物分子的分离效率成为可能，特别是分离蛋白质和/或多肽和/或肽组分。本专利技术的另一个目的是提供一种如上所述的电泳技术，此电泳技术能 够确保提供更好的分离效果，在工艺末端从初始样品中提取单个组分的更 好的操作性，继而使得更快地表征这些组分。本专利技术的又一个目的是提供一种能够更准确地从初始样品中鉴定单个 组分的电泳技术。本专利技术的再一个目的是提供了一种经济的、便于使用的并且可循环使 用的电泳技术。而且本专利技术还有一个目的是，提供了一种使预先的纯化/富 集样品的步骤减到最少从而降低样品损失的电泳技术。本专利技术的电泳技术还有其他目的，可用于分离生物样品中的生物分 子，特别是基于特定的化学和/或物理特性预先整理的蛋白质和/或多肽和/ 或肽组分。
技术实现思路
根据专利技术者的经验，从仪器的角度已经被认知的是，在分离生物样 品，特别是其中具有相似的特征(如分子量和/或等电点)的不同的蛋白质组 分，的分离效率的限制的主要原因是使用了特征是具有平行力线的电场，典型为双向电泳(2-D PAGE)。此项专利技术是一种具有非平行力线的电场，在基质B(matrix B)上转移并 分离生物样品中的蛋白质和/或多肽和/或肽组分的双向电泳技术类型。而这 些组分已预先根据其化学和/或物理特性在基质A(matrix A)上被整理。因此，这项专利技术的目的是提供了一种可以将包含在至少一个生物样品 中的生物分子同时分离的双向电泳方法，至少包括以下的步骤从至少一个第一基质(其中所述生物分子被包含在所述生物样品中并基 于化学和/或物理特性而整理)转移到至少一个第二基质(其中所述生物分子 被彼此分离)，并且转移和分离所述生物分子是通过具有非平行力线的电场 来实现的。本专利技术的进一步的目的是一个可以同时分离包含在至少一个生物样品 中的生物分子的双向电泳仪器，其中所述仪器在至少一个第一基质中(在 其中所述生物分子包含在所述生物样品中并基于化学和/或物理特性而被整 理)产生至少一个有非平行力线的电场，并在至少一个第二基质(在其中 所述生物分子被分离)中通过电场产生的方法所述的生物分子从所述的第 一基质转移到所述的第二基质，并通过该方法所述的生物分子被分离。这样的方法和仪器更适合于于分离具有相似的化学和/或物理特性的蛋 白质和/或多肽和/或肽组分，以及表征含有蛋白质组分的生物样品。附图说明图1:两个电极产生的具有径向扩散的电场例的示意图。图2:两个电极产生的具有径向扩散的圆扇型电场例的示意图。图3:多于两个电极产生的具有非平行力线的电场示意图。图4:通过具有径向扩散的非平行力线的电场的方法，适于分离生物分子(特别是基于特定化学和/或物理特性整理的蛋白质和/或多肽和/或肽组分)的仪器的一个可能的实施例示意图，图5:利用传统的双向电泳分离成纤维原细胞蛋白并以溴酚蓝指示的电泳前沿的凝胶图。图6:利用本专利技术分离成纤维原细胞蛋白并以溴酚蓝指示的电泳前沿 的凝胶图。图7:利用传统双向电泳的基于分子量分离蛋白质的分离成纤维原细 胞蛋白的凝胶图。图8:利用本专利技术中双向电泳基于分子量分离蛋白质的分离成纤维原 细胞蛋白质的凝胶图。 具体实施例方式下面的详细描述将有助于更好地了解本专利技术中的电泳方法和仪器的目 的和优势，并且其本质的特征和可能的实施例也将有所描述。用于同时分离包含在一个生物样品中的生物分子的电泳方法，包括至 少一个在一个适当的支持物上的一个适当的基质中分离所述的生物分子的步骤，所述生物分子特别是指蛋白质和/或多肽和/或肽，所述分离是通过应 用具有非平行力线的电场的方法来实现的，所述的电泳方法实际上是双向电泳方法，所述双向电泳方法是在一个仪器中实现，其中电场的力线由至 少两个电极确定，其中至少一个为阳极，至少一个为阴极。所述力线是在 第一基质A和第二基质B中确定的，其中第一基质A包括生物样品或准备 检测的样品；在第二基质B中生物分子组分特别是具有蛋白质性质的组分 通过所述电极的适当的几何构造和/或所述基质的形状和/或它们相对于电极 的位置和/或电极和基质之间包含的传导物质(电解缓冲液)而被转移继而被 分离。为了提供一个电泳槽中放置电极的首选位置，以获得具有非平行力线 的电场，可以将电极J放置于围绕圆心的环形平面上，所述圆心处则放置 有底顶杆型(puntiform)电极K(与J的极性相反)。已知， 一个电极槽中的不同的组成部分(容器、基质、电解缓冲液等) 能够影响电极产生的电场力线的方向和/或形状。因此，按照一定的方式放 置所述组成部分从而得到可重复的并适用于生物样品分离的电场力线是很 重要的。然而，这些电极以某种方式被放置从而在一个包括电极自身的平面区 域中产生充分连续或非连续的电场，其中电场具有非平行力线，并根据电 场本身的极性以及持续时间和密度的变化(基于电泳分离的样品类型)而表现 出发散或会聚形式。所产生的电场的性质会影响分离效果。电压的选择将基于由操作者本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于同时分离包含在至少一个生物样品中的生物分子的双向电泳方法，包括至少以下步骤：从至少一个第一基质转移，其中所述生物分子被包含在所述生物样品中并基于化学和／或物理特性被整理，在至少一个第二基质上所述生物分子被彼此分离，所述生物分子的转移和分离是应用具有非平行力线的电场引起的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷纳多米利奥尼，安东尼奥瓜达尼诺，马努拉缪佐，伊莉莎巴瑞娜，汤玛索萨拉塔，皮尔乔吉奥雷迪，
申请(专利权)人：鲁杰罗马西莫电气合股公司，兹普股份责任有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]