一种DNA双链标记化合物及其确定化合物结合靶标蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种DNA双链标记化合物，以及利用DNA双链标记化合物确定化合物结合靶标蛋白的方法，可用于发现化合物结合靶标和化合物作用机制。尤其适用于研究在临床实践发现有疾病治疗效果或在药物表型筛选中发现有疾病相关表型调控作用的已知化合物的结合靶标和作用机制，为新药发现提供作用机理。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA双链标记化合物及其确定化合物结合靶标蛋白的方法
本专利技术涉及一种DNA双链标记化合物，以及利用DNA双链标记化合物确定化合物结合靶标蛋白的方法，可用于发现化合物结合靶标和化合物作用机制。尤其适用于研究在临床实践发现有疾病治疗效果或在药物表型筛选中发现有疾病相关表型调控作用的已知化合物的结合靶标和作用机制，为新药发现提供作用机理。
技术介绍
药物发现有两条经典路径，一是通过表型筛选(Phenotypicscreen)或动物实验找到有效的化合物，再进一步研究化合物的结合靶标和起效分子机制；二是伴随20世纪50年代现代分子生物学兴起建立的靶标筛选策略，即首选锁定疾病相关的分子靶标，再筛选与靶标有作用的化合物分子，最后验证在整体动物实验等是否有效。据相关统计，在全球firstinclass一类新药发现中，表型筛选策略成功率更高，但表型筛选的瓶颈是往往难以找到起效化合物的结合靶标、机理不明成为药物进一步优化的障碍。寻找化合物结合靶标是制药研究领域持续关注的问题。目前相关技术手段涉及：蛋白组凝胶电泳、质谱分析、蛋白质组学研究、生物信息学手段，以及较为新近的向列蛋白组织沉淀技术(Nematicproteinorganizationtechnique,NPOT)等。但上述方法均有一定局限，如蛋白组凝胶电泳的操作分析冗繁、检测灵敏度有限、生物信息学分析依赖于较为丰富的蛋白质结构数据库的构建，且预测结果与真实有差异等。DNA双链标签用于标记和编码分子是早在20世纪90年代提出的概念，目前已有较成熟广泛的应用，技术核心是应用四种核苷酸排列组合形成特定DNA双链序列和特定结构化合物的一一对应关系进行编码和解码，但将该技术与在DNA双链序列中设计特定位点用限制性核酸内切酶酶切解离DNA双链标签的方法相结合是本专利技术首次提出，该专利技术主要针对不需要DNA双链核苷酸序列解码的研究，但研究需要排除尽可能多的背景无关杂蛋白，比如结合在磁珠包被链霉素、生物素和DNA双链序列上的无关蛋白。常规加热解离方法使蛋白变性与结合物质脱离，但该过程中与上述标记介质结合的无关蛋白也会脱离在同一体系形成分析干扰。
技术实现思路
本专利技术首先提供了一种DNA双链标记化合物，它具有式I所示的通式：生物素—DNA—X式I其中，X为工具化合物，DNA中包含限制性内切酶识别序列。进一步地，式I中DNA双链的长度为10～100bp；优选地，所述双链的长度为10～50bp。进一步优选地，所述双链的长度为25～50bp。进一步地，DNA双链中限制性内切酶识别序列在X端的0～30bp之内。进一步地，限制性内切酶识别序列为黏性末端限制性内切酶识别序列或平端限制性内切酶识别序列。进一步地，限制性内切酶识别序列为EcoR1、HindIII、BamHI、SalI、BalI、HaeIII、SmaI序列。进一步地，式I中生物素和DNA双链之间通过连接基团连接。更进一步地，式I中生物素通过生物素化-尿嘧啶核苷三磷酸引入至DNA双链的末端。进一步地，式I中DNA双链与X之间通过连接基团连接。更进一步地，式I中DNA与X之间共价连接的连接基团为：进一步地，X的分子量为100～4000Da。本专利技术提供了一种利用式I的DNA双链标记化合物，确定化合物结合蛋白靶标的方法，包括以下步骤：a.利用反复冻融法温和裂解细胞获得细胞总蛋白；b.在细胞裂解液中加入DNA双链标记化合物进行孵育；c.加入链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠进行孵育；d.通过离心或磁体分离出靶标蛋白-DNA双链标记化合物-链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的复合物；e.加入特定的限制性内切酶，使链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠-DNA的复合物部分被切除；f.通过离心或磁体分离，得到上清液；g.从上清液中确定潜在的靶标蛋白质；h.通过潜在靶标蛋白质与化合物的亲和力验证，确认靶标蛋白。进一步地，步骤a中反复冻融法为：将细胞悬于HBSS缓冲液中离心，弃上清，加入少量HBSS缓冲液将细胞重悬于离心管中，放置于液氮速冻，待样品完全冰冻后再放至冰上环缓慢融化，反复操作三次。进一步地，步骤b中加入的DNA双链标记化合物的浓度为0.1～10μM，孵育条件为4度低速摇床孵育1小时至过夜。进一步地，步骤c中加入链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的量满足其可结合生物素的摩尔数大于反应体系中化合物总摩尔数的三倍，孵育条件为4℃低速摇床孵育1小时至过夜。进一步地，步骤d中分离前加入10倍体积的HBSS溶液，并重复3～5次离心或磁体分离，以除去未结合蛋白。进一步地，在步骤d之后可以重悬分离进一步洗去未结合蛋白。进一步地，步骤e中加入1000～10000单位的限制性核酸内切酶及其缓冲溶液，液体体积为50～200μL。进一步地，步骤g中使用蛋白组学的方法确定潜在的靶标蛋白。进一步地，步骤h中使用生物物理和/或生物化学的方法来验证靶标蛋白和化合物的相互作用，从而确认化合物的靶标。本专利技术利用限制性核酸内切酶在DNA双链标签的近化合物端酶切直接分离双链，直接将结合在磁珠、生物素和DNA双链序列上的无关蛋白伴随结合的磁珠一起沉淀实现最大程度排除干扰。该方法引入了限制性核酸内切酶和酶缓冲液中可能存在的牛血清蛋白(BSA)，它们形成了下游质谱分析中的干扰蛋白，但由于它们均是已知蛋白，可以较为明确地在下游蛋白组学分析中排除，比传统方法中排除结合在标记介质上的大量未知蛋白更容易。本专利技术首次将限制性核酸内切酶应用、生物素标记与DNA双链标签标记化合物技术相结合，用于富集纯化化合物结合的未知靶标，再辅以下游质谱检测明确靶标性质。该方法通过双链偶连、共价结合富集和特异酶切DNA双链的方式将大量无关背景蛋白洗脱，减少了信号噪音和数据分析的复杂程度，为快速发现起效化合物的结合靶标和药效学分子机制提供了一种相对操作简单、信号特异保真的方法。本专利技术采用限制性核酸内切酶切断DNA，反应条件温和、特异性高，不容易对靶标蛋白产生其它影响。本专利技术中的DNA双链中的单个或部分的脱氧核糖核苷酸在不影响限制性内切酶对识别序列进行切割的情况下，可替换为核糖核苷酸。本专利技术中限制性内切酶识别序列EcoR1、HindIII、BamHI、SalI、BalI、HaeIII、SmaI分别如下：本专利技术中HBSS缓冲液是指Hank's平衡盐溶液。本专利技术中生物素(Biotin)也称为D-生物素、维生素H等，化学名为5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸或六氢-2-氧代-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-戊酸。本专利技术中DNA双链与X之间可以通过常见的连接基团连接，例如可以使用如下已公开的连接基团进行连接：显然，根据本专利技术的上述内容，按照本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA双链标记化合物，其特征在于：它具有式I所示的通式：/n生物素—DNA—X/n式I/n其中，/nX为工具化合物；/nDNA双链中包含限制性内切酶识别序列。/n

【技术特征摘要】
20190320 CN 20191020563771.一种DNA双链标记化合物，其特征在于：它具有式I所示的通式：
生物素—DNA—X
式I
其中，
X为工具化合物；
DNA双链中包含限制性内切酶识别序列。


2.根据权利要求1所述的DNA双链标记化合物，其特征在于：式I中DNA双链的长度为10～100bp；优选地，所述双链的长度为10～50bp。


3.根据权利要求1所述的DNA双链标记化合物，其特征在于：DNA双链中限制性内切酶识别序列在X端的0～30bp之内。


4.根据权利要求1所述的DNA双链标记化合物，其特征在于：限制性内切酶识别序列为黏性末端限制性内切酶识别序列或平端限制性内切酶识别序列。


5.根据权利要求4所述的DNA双链标记化合物，其特征在于：限制性内切酶识别序列为EcoR1、HindIII、BamHI、SalI、BalI、HaeIII、SmaI序列。


6.根据权利要求1所述的DNA双链标记化合物，其特征在于：式I中生物素和DNA双链之间通过连接基团共价连接。


7.根据权利要求6所述的DNA双链标记化合物，其特征在于：式I中生物素通过生物素化-尿嘧啶核苷三磷酸引入至DNA双链的末端。


8.根据权利要求1所述的DNA双链标记化合物，其特征在于：式I中DNA与X之间通过连接基团共价连接。


9.根据权利要求8所述的DNA双链标记化合物，其特征在于：式I中DNA与X之间共价连接的连接基团为：





10.根据权利要求1所述的DNA双链标记化合物，其特征在于：X的分子量为100～4000Da。


11.一种利用式I的DNA双链标记化合物，确定化合物结合蛋白靶标的方法，包括以下步骤：
a.利用反复冻融法温和裂解细胞获得细胞总蛋白；
b.在细胞裂解液中加...

【专利技术属性】
技术研发人员：李进，巩晓明，张毅，陈秋霞，窦登峰，刘观赛，王钊，万金桥，李萍，罗华东，
申请(专利权)人：成都先导药物开发股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51