利用环形RNA进行蛋白翻译及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种利用环形RNA进行蛋白翻译及其应用，具体地，本发明专利技术提供一种环形RNA构建物，所述环形RNA构建物从5’‑3’方向具有式I所示的结构：TI‑Z1‑Z2 (I)，式中，TI为翻译起始元件；Z1为表达外源蛋白的表达盒；Z2为无或其他元件。本发明专利技术的环形RNA构建物在体内体外均可显著增强翻译效率。

【技术实现步骤摘要】
利用环形RNA进行蛋白翻译及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及利用环形RNA进行蛋白翻译及其应用。
技术介绍
蛋白质是生物体内最重要的生物大分子，其突变或者表达异常都会导致疾病发生。因而，通过蛋白质替代或者表达可以治疗相应的疾病。常见的蛋白质替代或者表达疗法包括基于核糖核酸(DNA)载体的递送系统、基于脱氧核糖核酸(RNA)载体的递送系统以及蛋白质递送系统。这些方法都需要通过信使RNA翻译产生蛋白质。在真核生物体内常见的翻译起始方式是帽依赖性翻译，其主要通过翻译起始因子识别信使RNA5′端的特殊帽结构来起始翻译，该类翻译方式只存在于线性信使RNA中存在。此外，还存在着一类非帽依赖性的翻译起始，其主要通过特定蛋白因子与RNA元件间的互作启动翻译。这类翻译可以在线性或者环形RNA中起始翻译。常见的非帽依赖性翻译起始元件是病毒RNA中一些具有特定二级结构的元件，它们可以借用宿主细胞的翻译系统表达自己所需的蛋白质。例如，脑心肌炎病毒或者丙型肝炎病毒等RNA中含有的内部核糖体进入位点(InternalRibosomeEntrySite：IRES)元件。环形RNA是一类不同于线性RNA的单链闭环RNA形式，因其结构特异性导致其不易被核酸外切酶降解，顾其相较于线性RNA更稳定。所以，通过环形RNA翻译表达蛋白具有更加持续长效的特点，是替代线性RNA翻译的一种重要手段。但因环状RNA的翻译只能利用非帽依赖性翻译的反式，如何设计并选择合适的非帽翻译起始元件是该应用的关键技术。一种常见的手段是利用病毒IRES启动环形RNA的翻译，但由于致病病毒RNA在宿主体内可能存在免疫排斥反应，同时病毒来源的RNA元件基本都含有复杂的RNA二级结构而且较长的序列，限制了基于病毒IRES的表达系统构建及后期的基因治疗应用。因此，本领域迫切需要开发一种非病毒来源的非帽依赖性翻译起始元件。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种非病毒来源的非帽依赖性翻译起始元件。本专利技术第一方面提供了一种环形RNA构建物，所述环形RNA构建物从5’-3’方向具有式I所示的结构：TI-Z1-Z2(I)式中，TI为翻译起始元件；Z1为表达外源蛋白的表达盒；Z2为无或其他元件；并且，各“-”为键或核苷酸连接序列；其中，TI元件的长度为6-30nt，较佳地，8-24nt，更佳地，10-20nt；在TI元件中，A的含量≥35％，较佳地，≥45％，更佳地，≥60％；在TI元件中，T的含量≥20％，较佳地，≥30％，更佳地，≥50％；在TI元件中，A+T的含量≥65％，较佳地，≥80％，更佳地，≥90％；在TI元件中，G的含量≤35％，较佳地，≤25％，更佳地，≤10％。在另一优选例中，所述环形RNA构建物为环形信使RNA构建物。在另一优选例中，所述TI元件中，A的含量为35-100％，较佳地，45-100％，更佳地，60-100％。在另一优选例中，所述TI元件中，T的含量为20-100％，较佳地，30-100％，更佳地，50-100％。在另一优选例中，所述TI元件中，A+T的含量为65-100％，较佳地，80-100％，更佳地，90-100％。在另一优选例中，所述TI元件中，G的含量为0-35％，较佳地，0-25％，更佳地，0-10％。在另一优选例中，所述TI元件含有表1所示的选自下组的一种或多种核苷酸序列：表1在另一优选例中，所述TI元件在表1所示的核苷酸序列的5'端和/或3'端添加1-24个(较佳地1-15，更佳地1-10个，更佳地，1－6个)核苷酸，且具有TI元件的功能。在另一优选例中，所述TI元件的编码序列选自下组；(a)序列如SEQIDNO.:1－40所示的多核苷酸；(b)核苷酸序列与SEQIDNO.:1－40所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％或≥98％或≥99％)的多核苷酸；(c)在SEQIDNO.:1-40所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-18个(较佳地1-10，更佳地1-6个)核苷酸的多核苷酸；(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述TI元件具有如SEQIDNO.:1-40所示的序列。在另一优选例中，所述TI元件的编码序列如SEQIDNO.:1-40所示。在另一优选例中，所述Z1元件含有终止密码子。在另一优选例中，所述Z1元件不含有终止密码子。在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自原核生物、真核生物。在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自动物、植物、病原体。在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠。在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码序列选自下组：编码荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域的外源DNA、萤光素酶突变体的DNA、或其组合。在另一优选例中，所述外源蛋白选自下组：荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、萤光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αA、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。在另一优选例中，所述Z2元件选自下组：PolyA、多克隆位点、适配体、miRNA结合位点、翻译增强元件、或其组合。在另一优选例中，所述TI元件的一个或多个腺嘌呤(A)被甲基化。在另一优选例中，所述环形RNA的构建物的序列如SEQIDNO.:61所示。本专利技术第二方面提供了一种载体，所述载体含有本专利技术第一方面所述的构建物的表达盒。在另一优选例中，所述表达盒含有第一内含子和第二内含子。在另一优选例中，所述第一内含子和第二内含子完全互补或不完全互补。在另一优选例中，所述载体具有SEQIDNO.:62所示的序列。在另一优选例中，所述第一内含子的序列如SEQIDNO.:63所示。在另一优选例中，所述第二内含子的序列如SEQIDNO.:64所示。本专利技术第三方面提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞的基因组的一个或多个位点整合有本专利技术第一方面所述的核酸构建物，或者所述基因工程细胞中含有本专利技术第二方面所述的载体。在另一优选例中，所述基因工程细胞包括原核细胞、真核细胞。在另一优选例中，所述真核细胞包括高等真核细胞。在另一优选例中，所述基因工程细胞选自下组：人源细胞(如Hela细胞)、中国仓鼠卵巢细胞、昆虫细胞、麦胚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环形RNA构建物，其特征在于，所述环形RNA构建物从5’-3’方向具有式I所示的结构：/nTI-Z1-Z2 (I)/n式中，/nTI为翻译起始元件；/nZ1为表达外源蛋白的表达盒；/nZ2为无或其他元件；/n并且，各“-”为键或核苷酸连接序列；/n其中，TI元件的长度为6-30nt，较佳地，8-24nt，更佳地，10-20nt；/n在TI元件中，A的含量≥35％，较佳地，≥45％，更佳地，≥60％；/n在TI元件中，T的含量≥20％，较佳地，≥30％，更佳地，≥50％；/n在TI元件中，A+T的含量≥65％，较佳地，≥80％，更佳地，≥90％；/n在TI元件中，G的含量≤35％，较佳地，≤25％，更佳地，≤10％。/n

【技术特征摘要】
1.一种环形RNA构建物，其特征在于，所述环形RNA构建物从5’-3’方向具有式I所示的结构：
TI-Z1-Z2(I)
式中，
TI为翻译起始元件；
Z1为表达外源蛋白的表达盒；
Z2为无或其他元件；
并且，各“-”为键或核苷酸连接序列；
其中，TI元件的长度为6-30nt，较佳地，8-24nt，更佳地，10-20nt；
在TI元件中，A的含量≥35％，较佳地，≥45％，更佳地，≥60％；
在TI元件中，T的含量≥20％，较佳地，≥30％，更佳地，≥50％；
在TI元件中，A+T的含量≥65％，较佳地，≥80％，更佳地，≥90％；
在TI元件中，G的含量≤35％，较佳地，≤25％，更佳地，≤10％。


2.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述TI元件含有表1所示的选自下组的一种或多种核苷酸序列：
表1




。


3.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述TI元件的编码序列选自下组；
(a)序列如SEQIDNO.:1－40所示的多核苷酸；
(b)核苷酸序列与SEQIDNO.:1－40所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％或≥98％或≥99％)的多核苷酸；
(c)在SEQIDNO.:1-40所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-18个(较佳地1-10，更佳地1-6个)核苷酸的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。


4....

【专利技术属性】
技术研发人员：王泽峰，杨赟，樊晓娟，
申请(专利权)人：中国科学院上海营养与健康研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31