一种高活性T细胞体外培养试剂盒及培养方法技术

本发明专利技术涉及一种高活性T细胞体外培养试剂盒，包括：主要成分为zometa、PHA、her‑2、INF‑γ的诱导液，主要成分为IL‑2的刺激液，主要成分为IL‑2、IL‑1α、IL‑7的活化液，主要成分为IL‑2、IL‑21的扩增液。前述体外培养试剂盒能方便临床上同时培养一次回输两种细胞(γδT细胞和CIK细胞)，减少实验操作风险，缩短操作人员操作时间和细胞培养周期，有效减少试剂耗材的使用。

【技术实现步骤摘要】
一种高活性T细胞体外培养试剂盒及培养方法
本专利技术属于免疫细胞治疗
，尤其涉及一种高活性T细胞(HighlyactiveTcells，HAT)体外培养试剂盒及培养方法。
技术介绍
细胞免疫疗法是一种新型且具有显著疗效的生物治疗技术，这种利用改造自身免疫抗癌的新型治疗方法，主要是运用生物技术和生物制剂对患者采集的自身的免疫细胞进行体外培养和改造然后回输到患者体内的方法，来激发识别和引导免疫杀伤肿瘤细胞从而增强机体自身免疫功能，达到治疗肿瘤的效果。γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成。它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。γδT细胞可以杀灭癌细胞，无须外增靶向性。细胞治疗副作用小，γδT细胞免疫疗法副作用小或无副作用。γδT细胞几乎对所有的癌细胞起杀伤作用。CIK细胞是由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，并具有识别多种肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用。CIK细胞和γδT细胞对肿瘤杀伤、人体免疫保护起着重要作用。CIK细胞和γδT细胞回输的常规做法是先对外周血单个核细胞分别诱导分化为CIK细胞和γδT细胞，单独扩增培养后，再把两种细胞混合回输到人体内。这种单独培养后混合回输的方法，增加了实验操作风险，增加了操作人员操作时间和细胞培养周期，试剂耗材的使用也大大增加，也增加了治疗费用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于构建一种高活性T细胞体外培养试剂盒及培养方法，方便临床上同时培养一次回输两种细胞，减少实验操作风险，缩短操作人员操作时间和细胞培养周期，有效减少试剂耗材的使用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种高活性T细胞体外培养试剂盒，包括主要成分为zometa、PHA、her-2、INF-γ的诱导液，主要成分为IL-2的刺激液，主要成分为IL-2、IL-1α、IL-7的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。作为进一步的方案，所述诱导液1ml、刺激液1ml、活化液1ml、扩增液1ml。作为一种可能方案，所述诱导液中，zometa、PHA、her-2、INF-γ的有效浓度范围分别为1ug/ml～10ug/ml、1ug/ml～10ug/ml、10ug/ml～30ug/ml和100IU/ml～1000IU/ml。作为进一步的方案，所述诱导液中，zometa、PHA、her-2、INF-γ的有效浓度分别为1ug/ml、5ug/ml、25ug/ml和500IU/ml。作为一种可能方案，所述刺激液中，IL-2的有效浓度范围为500IU/ml～1500IU/ml。作为进一步的方案，所述刺激液中，IL-2的有效浓度为1000IU/ml。作为一种可能方案，所述活化液中，IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/ml～50IU/ml、10IU/ml～100IU/ml。作为进一步的方案，所述活化液中，IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度分别为400IU/ml、10IU/ml、50IU/ml。作为一种可能方案，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、20IU/ml～60IU/ml。作为进一步的方案，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为400IU/ml、50IU/ml。前述体外培养试剂盒能方便临床上同时培养一次回输两种细胞(γδT细胞和CIK细胞)，减少实验操作风险，缩短操作人员操作时间和细胞培养周期，有效减少试剂耗材的使用。一种利用前述试剂盒培养高活性T细胞的培养方法，包括下列步骤：(1)制备单个核细胞：使用肝素钠抗凝采血管采集人外周血40ml，并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用。(2)单个核细胞用40ml含10％自体灭活血浆的诱导液吹打均匀，使细胞密度范围为1.5-2.0×106cell/ml，装入悬浮细胞培养瓶静置于37℃5％CO2培养箱培养。(3)Day1补加1ml刺激液至培养瓶内。(4)制备活化培养基:吸取1ml活化液加入500mlALyS505N-0培养基内配制成活化培养基；Day3、Day5、Day7均使用活化培养基进行补液，共500ml，均置于37℃5％CO2培养箱培养。(5)制备扩增培养基:吸取1ml扩增液加入2LALyS505N-0内配制成扩增培养液；Day7转到细胞培养袋扩大培养，Day9和Day11使用扩增培养液对细胞进行补液，静置于37℃5％CO2培养箱培养。(6)培养Day14收获细胞，计数并进行检测，其中，利用CD3+CD56+和CD3+γδ+进行表型检测。本专利技术有如下效果：(1)本专利技术通过构建一种高活性T细胞体外培养试剂盒及培养方法，利用同一个细胞培养周期、同一个培养体系内培养出两类效应细胞。解决了以前细胞免疫治疗所提倡的多细胞联合治疗，而传统的诱导单一效应细胞的方式，不但增加了细胞培养人员的操作负担，而且相对而言增加了耗材等的消耗，从而加重患者的经济支出的问题。即本专利技术摒弃传统的诱导单一效应细胞的观念，同时诱导两类效应细胞，既达到了多细胞治疗的目的，又减少了不必要的耗材浪费从而降低经济成本。(2)本专利技术T细胞(γδT与CIK细胞)培养方法，只需采集患者外周血40ml，采血量少，且无需使用细胞分选等系统，减轻患者痛苦及医疗成本。(3)本专利技术提供的试剂盒与培养方法，培养周期为14天，培养周期短，即可获得高纯度、高数量、高杀伤力的γδT与CIK细胞。(4)本专利技术提供的试剂盒采用的成分均为临床治疗级别药物或因子，避免了外源性动物成分的带入，对细胞培养无毒副作用。(5)本专利技术提供的试剂盒与培养方法操作简单，无需包被培养瓶，无需额外添加其它试剂和因子。(6)本专利技术提供的试剂盒与培养方法培养γδT与CIK细胞，可使γδT及CIK细胞培养标准化，减少误差，是一个实用性高、操作简便的商品化试剂盒。综上所述，本专利技术在现有的γδT及CIK细胞单独培养的基础上，开发出一种高活性T细胞(HAT)试剂盒即γδT与CIK细胞共培养的试剂盒，既降低了细胞培养成本，缩短操作人员操作时间和细胞培养周期，又提高了细胞培养的安全性，使γδT与CIK细胞共培养标准化、简单化。为细胞治疗临床广泛应用和研究提供了优质的培养方案。共培养的CIK细胞和γδT细胞具有多重杀伤肿瘤机制，杀瘤能力强。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高活性T细胞体外培养试剂盒，其特征在于，主要包括：主要成分为zometa、PHA、her-2、INF-γ的诱导液，主要成分为IL-2的刺激液，主要成分为IL-2、IL-1α、IL-7的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。/n

【技术特征摘要】
1.一种高活性T细胞体外培养试剂盒，其特征在于，主要包括：主要成分为zometa、PHA、her-2、INF-γ的诱导液，主要成分为IL-2的刺激液，主要成分为IL-2、IL-1α、IL-7的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导液1ml、刺激液1ml、活化液1ml、扩增液1ml。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导液中，zometa、PHA、her-2、INF-γ的有效浓度范围分别为1ug/ml～10ug/ml、1ug/ml～10ug/ml、10ug/ml～30ug/ml和100IU/ml～1000IU/ml。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导液中，zometa、PHA、her-2、INF-γ的有效浓度分别为1ug/ml、5ug/ml、25ug/ml和500IU/ml。


5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述刺激液中，IL-2的有效浓度范围为500IU/ml～1500IU/ml。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述刺激液中，IL-2的有效浓度为1000IU/ml。


7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述活化液中，IL-2、IL-1α、IL-7的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/ml～50IU/ml、10IU/ml～100IU/ml。


8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述活化...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔伟圣，蓝欣，冉红，陈智妍，
申请(专利权)人：珠海贝索细胞科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44