一种干细胞由Primed态向*态转化的方法技术

本发明专利技术公开了一种Primed态干细胞向

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞由Primed态向*态转化的方法
本专利技术涉及细胞生物学领域，具体涉及一种Primed态干细胞向态干细胞转化的方法。
技术介绍
多能性的细胞具有产生除胚外滋养层细胞谱系的所有胚胎胚层及原始生殖细胞的潜力。最近的一系列研究关注了具有不同的遗传和表观遗传性状的多能细胞：(原始态)状态多能干细胞(pluripotentstemcells,PSCs)和primed(激发态)状态PSCs。在着床前小鼠胚胎内细胞群(innercellmass,ICM)中，外胚层启动了多能性因子Nanog的表达，基因组结构呈现低甲基化状态，雌性体内失活的X等位基因重新激活，这种多能性状态被称为状态。小鼠胚胎着床后，状态的ICM很快被primed多能性的外胚层(epiblast)细胞所取代。这些primed多能性的细胞内Nanog表达量下降，基因组甲基化水平上升，雌性个体中的一条X染色体失活。和primed状态的PSCs最显著的差异体现在发育潜能上，状态的小鼠胚胎干细胞(mESC)可以通过四倍体胚胎互补技术(tetraploidembryocomplementation,TEC)得到完全的由ESCs来源的小鼠，这是检测mESCs是否具有性状的黄金标准，primed状态mESCs不能通过TEC获得干细胞来源的小鼠后代。总的来说状态PSCs与primed状态PSCs相比拥有更高的多能性，因此在再生医学及疾病建模等领域拥有更广阔的应用前景。化学小分子化合物在细胞重编程领域的作用逐渐被大家应用，它们有的可以提高重编程诱导效率，有的可以取代某一个或几个转录因子。化学小分子还具有转基因方法不可比拟的优势，例如小分子浓度和加入时间可控、不产生免疫原性、耗费低以及便于生产保存和标准化。但是，转基因重编程方法潜在的临床应用上有一定的不安全性，因此探索化学小分子完全替代外源的转录因子实现体细胞重编程极为重要，亟需一种Primed态干细胞向态干细胞转化的方法。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述问题，提供了激发态干细胞向原始态干细胞转化的方法，化学诱导细胞重编程,利用小分子组合将激发态干细胞转化成原始态干细胞。本专利技术目的之一在于提供一种Primed态干细胞向态干细胞转化的组合物，具体技术方案如下：一种Primed态干细胞向态干细胞转化的主药组合物，其特征在于，所述组合物由1XN2补充剂、1XB2补充剂、β-氢硫基乙醇、达沙替尼、AZD5438、SB590885、PD0325901、Y-27632、IL6/sIL-6R、重组人激活素-A组成。本专利技术目的之二在于提供一种Primed态干细胞向态干细胞转化的制剂组合物，具体技术方案如下：一种Primed态干细胞向态干细胞转化的制剂组合物，所述制剂组合物由主药成分和辅料成分组成，所述主药成分由1XN2补充剂、1XB2补充剂、β-氢硫基乙醇、达沙替尼、AZD5438、SB590885、PD0325901、Y-27632、IL6/sIL-6R、重组人激活素-A组成。进一步的，所述制剂组合物还包括F12DMEM培养基、Neurobasal培养基、1XL-谷氨酰胺、1X-非必要氨基酸、柠檬酸钠、牛血清白蛋白、基本成纤维细胞生长因子。进一步的，所述F12DMEM培养基和所述Neurobasal培养基的体积比为1：1。进一步的，牛血清白蛋白和柠檬酸钠的摩尔比为1：1。进一步的，牛血清白蛋白和IL6/sIL-6R的摩尔比为5：2。进一步的，β-氢硫基乙醇与达沙替尼的摩尔比为1000：1。进一步的，所述达沙替尼、AZD5438和SB590885的摩尔比为1：1：1。进一步的，所述达沙替尼、AZD5438、SB590885、PD0325901和Y-27632的摩尔比为1：1：1：10：100。进一步的，所述PD0325901和Y-27632的摩尔比为1：10。进一步的，所述IL6/sIL-6R、重组人激活素-A和基本成纤维细胞生长因子的摩尔比为5：5：2。本专利技术目的之三在于提供一种Primed态干细胞向态干细胞转化的方法，具体步骤如下：(1)将Primed态干细胞加入权利要求2所述的制剂组合物里以一定的培养时间进行培养。(2)用胰蛋白酶TrypLE(gibco)溶液在30×稀释的Matrigel胶包被或者铺满feeder的培养皿中将步骤(1)中培养的细胞传代为单个细胞。(3)用1×PBS清洗步骤(2)中得到的单个细胞，并用胰蛋白酶分离细胞至细胞培养基中以一定孵育条件进行孵育。(4)步骤(3)中孵育得到的细胞以高比例1：2接种在涂覆的板上，移至缺氧环境进行后续传代培养，通过检测相关基因表达情况，筛选得到态干细胞。进一步的，步骤(1)中所述的培养时间为4-5天。进一步的，步骤(3)中所述孵育条件为温度37℃下孵育1-2分钟。进一步的，步骤(4)中所述缺氧环境为5％O2，5％CO2。进一步的，步骤(4)中所述传代培养至少为5代。进一步的，步骤(4)中所述相关基因为KLF4、KLF5、DPPA3、DPPA5、DNMT3L、NANOG。进一步的，步骤(4)中所述态干细胞的相关基因的表达活跃于Primed态干细胞。本专利技术的目的之四在于提供一种Primed态干细胞向态干细胞转化的主药组合物在制备Primed态干细胞向态干细胞转化的培养基中的运用。本专利技术的目的之五在于提供一种Primed态干细胞向态干细胞转化的制剂组合物在制备Primed态干细胞向态干细胞转化的培养基中的运用。本专利技术的有益之处在于：解决了因为人体多能干细胞的直接获取受到伦理限制，导致获取多能干细胞受限。本专利技术利用小分子组合将激发态干细胞转化成原始态干细胞的方法，化学诱导细胞重编程扩展多潜能干细胞的获取技术，为干细胞在再生医学领域的应用提供了材料基础，为细胞命运决定研究的模型，为生殖医学及拯救濒危野生动物提供实践基础。附图说明图1为本专利技术的Primed态干细胞及Naive态干细胞的细胞表型图2为本专利技术的Primed态干细胞及Naive态干细胞状态细胞的相关基因表达情况图3为本专利技术的Primed态干细胞及Naive态干细胞的蛋白表达情况具体实施方式下面通过实施例和附图，对本专利技术进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的结构思路、使用范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，采用原料如下：本专利技术通过对细胞培养的组分和浓度的调整，从而激发Primed态干细胞向态干细胞转化，此组分及其相应浓度是现有技术中没有记载本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Primed态干细胞向

【技术特征摘要】
1.一种Primed态干细胞向态干细胞转化的主药组合物，其特征在于，所述主药组合物由N2补充剂、B2补充剂、β-氢硫基乙醇、达沙替尼、AZD5438、SB590885、PD0325901、Y-27632、IL6/sIL-6R、重组人激活素-A组成。


2.一种由权利要求1中所述的主药组合物组成的制剂组合物，其特征在于，所述制剂组合物还包括F12DMEM培养基、Neurobasal培养基、L-谷氨酰胺、非必要氨基酸、柠檬酸钠、牛血清白蛋白、基本成纤维细胞生长因子。


3.根据权利要求2所述的制剂组合物，其特征在于，β-氢硫基乙醇与达沙替尼的摩尔比为1000：1。


4.根据权利要求2所述的制剂组合物，其特征在于，所述达沙替尼、AZD5438、SB590885、PD0325901和Y-27632的摩尔比为1：1：1：10：100。


5.根据权利要求2所述的制剂组合物，其特征在于，所述IL6/sIL-6R、重组人激活素-A和基本成纤维细胞生长因子的摩尔比为5：5：2。


6.一种干细胞由Primed态向态转化的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹杰，
申请(专利权)人：重庆生命知源科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50