免疫荧光技术检测蚊虫体内登革病毒的方法技术

免疫荧光技术检测蚊虫体内登革病毒的方法，采用人工经口感染蚊虫ＤＥＮ－２病毒，分别用细胞培养接种及蚊头部压片免疫荧光法进行了检测，用蚊头部压片免疫荧光技术，检测出蚊体内是否携带病毒。本发明专利技术取单只饱血感染的白纹伊蚊－２０℃冻麻，在解剖镜下用手术刀将蚊头部切下，置于玻片上用解剖针挤压头部，使脑内物质流出、涂匀；晾干后用预冷丙酮固定１０ｍｉｎ；滴加用ＰＢＳ稀释的小鼠抗ＤＥＮ－２病毒ＩｇＧ；放湿盒内；在３７℃条件下孵育３０ｍｉｎ，ＰＢＧＳ洗涤３次，自然晾干后滴加用伊文氏蓝ＰＢＳ稀释至工作浓度的羊抗鼠ＩｇＧ－ＦＩＴＣ、３７℃孵育３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤，于荧光显微镜下观察染色结果。采用本发明专利技术可做到早期诊断或及早发现阳性蚊媒，从而控制登革热的播散。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒检测的方法，尤其涉及免疫荧光技术检测蚊虫体内登革病毒的 方法。
技术介绍
登革热和登革出血热(DF/DHF)是由黄病毒属的4个型登革病毒引起的虫媒 病毒病，广泛流行于全球热带和亚热带地区，以东南亚国家最为严重，我国自1978 年以来也在海南和广东沿海一带发生了较大的流行。目前检测登革病毒感染的方法 仍离不开动物接种舰细胞培养接种分离，实验结果表明，采用细胞接种培养分离 法检测登革病毒是确诊流行病菌病菌原较为可靠的方法，但费时、繁琐，需要严 格的实验割牛，并且至少l周时间内能出结果，达不到早期、快速诊断的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，克服现有技术的不^处，^f共一种免疫荧光技术检测蚊 虫体内登革病毒的方法，直接,AlfiL液标本或媒介蚊体内检测出登革病毒抗原，做到 早期诊断，早发现阳性蛟媒，从而控制登革热的播散。本专利技术戶欣免疫荧光技术检须敝虫体内登革病毒的方法，采用AX经口感染蚊 虫DEN-2病毒，分别用细胞培养接种_^:头部压片免疫荧光法进行了检测，确认 :^S伊蚊、白纹伊蛟和C6/36细胞成功感染了病毒。用蚊头部压片免疫荧光技术, 可直接检测出蛟体内是否携带病毒，比细胞培养和乳鼠接种更为简便、省时、敏感。 20天内均能检测出蛟体携带病毒的状况。本专利技术所述方法为今后媒介蚊虫现场监测 打下了良女 S础。本专利技术戶脱的，取单 只t恤感染的白纹伊蚊一20'C冻麻。在解剖镜下用手术刀将蛟头部切下，置于玻片 上用解剖针挤压头部，j鹏内物质流出、涂匀；晾干后用预冷丙酮固定10min;滴 加用PBS稀释的小鼠抗DEN-2病毒IgG;放湿盒内;在37'C^f牛下孵育30 min， PBGS 洗涤3次，自然晾干后滴加用伊文氏蓝PBS稀释至工作浓度的羊抗鼠IgG-FITC、 37。C孵育30min， PBS洗涤，于荧光显微镜下观察染色结果。采用本专利技术戶诚免疫荧光駄检观敝虫体内登革病毒的方法，可以省去病毒分离培养这一步，直接/她液标本纖介蚊体内检测出登革病毒抗原，无疑可做到早 期诊断或及早发现阳性蚊媒，从而控制登革热的播散。 附图i兌明附图是本专利技术所述步骤框图。1—取野外现场捕捉的舰伊蚊、白纹伊i^文在-2(TC冻麻2—取一只放在解剖镜下用 手术刀将蚊头部切下，置于载玻片上用解剖针挤压头部，使脑内物质流出，涂匀3 ^TP后用预冷丙酮固定10min;滴加用PBS稀释的小鼠抗DEN-2病毒IgG放湿 盒内；37-C孵育30min， PBGS洗涤3次4一自然晾干后滴加用伊文氏蓝PBS稀 释至工作浓度的羊抗鼠IgG-FITC，37。C孵育30min， PBS洗涤，自然晾干5—将 载玻片放于荧光显微镜下观察染色结果 具体实施例方式现参照附图，结合实施例说明如下，采用人工经口感染蚊虫DEN-2 病毒，分别用细胞培养接种及蚊头部压片免疫荧光法进行了检测，确认駄伊蚊、 白纹伊蚊和C6/36细胞成功感染了病毒。用蚊头部压片免疫荧光技术，可直接检测 出蚊体内是否携带病毒，比细胞培养和乳鼠接种更为简便、省时、敏感。20天内均 育g检测出蚊体携带病毒的状况。本专利技术戶服方法为今后媒介蚊虫现场监测打下了良 女M础。本专利技术所述的，取单只t&lf[L感 染的白纹伊蚊一20°C冻麻。在解剖镜下用手术刀将蚊头部切下，置于玻片上用解剖 针挤压头部，使脑内物质流出、涂匀；晾干后用预冷丙酮固定10min;滴加用PBS 稀释的小鼠抗DEN-2病毒IgG;放湿盒内;在WC条件下孵育30min， PBGS洗涤3 次，自然晾干后滴加用伊文氏蓝PBS稀释至工作浓度的羊抗鼠IgG-FITC、 37°(:孵 育30min， PBS洗涤，于荧光显微镜下观察^结果。免疫荧光技术检测蛟虫体内登革病毒微用材料1 .蚊虫,伊蚊、白纹伊蚊为军事医学科学院微生物学流行病学研究所昆虫养殖室常 年饲养的敏感品系。以及野外现场捕捉的蚊虫。2 .病毒试验用的DEN-2为New Guinea B株由军事医学禾斗学院〗敫生物学流行病学研 究所劍共。乳鼠颅内传代，以细胞维持液研磨发病乳鼠脑组织帝喊10% (w/v)悬液，5000 rpm离心15mir^取上清用作病毒液备用。3. C6/36细胞来自于白纹伊蚊幼虫的传代细胞，用DMEM培养液28-C C02 i咅养箱内传代 培养。4. 抗体DEN-2单克隆抗体，羊抗鼠IgG-FITC; 0.01%PH7.4伊文氏蓝PBS液。5. 鼠脑病毒悬液制备给出生1-3天乳鼠脑内接种DEN-2病毒液0.02ml/鼠后，逐日观察，5-7天内 乳鼠，出现典型的神经症状，待乳鼠濒死期无菌取出鼠脑，研磨，用无血清 DMEM培,制成20%病毒悬液，于液氮中冻存备用。C6/36细胞测定病毒滴度 TCID50 (细胞感染病毒半数感染量)为1089~1()5。6. 蚊虫经口感染DEN-2病毒,伊蚊、白纹伊蛟按常规室内饲养，,后3-5天转小蚊笼内饥饿24h。将 新采肝素抗凝小鼠眼球血、用血清DMEM作10—i稀释的DEN-2病毒鼠脑悬液和10% 蔗糖水作1:1:1混合，相当于病毒滴度1075TCID50，加于海绵上，置蚊笼内， 虫吸食，第2天开始对饱血雌蚊进行带毒检测。免疫荧光技术检测蚊虫体内登革病毒方法步骤第一步取野外现场捕捉的駄伊蚊、白纹伊^^在-2(TC冻麻；第二步取一只放在解剖镜下用手术刀将蛟头部切下，置于载玻片上用解剖针 挤压头部，{ 内物质流出，涂匀；第三步晾干后用预冷丙酮固定10min;滴加用PBS稀释的小鼠抗DEN-2病毒 IgG放湿盒内；37。C孵育30min， PBGS洗涤3次；第四部自然晾干后滴加用伊文氏蓝PBS稀释至工作浓度的羊抗鼠IgG-FITC， 37。C孵育30min， PBS洗涤，自然晾干；第五步将载玻片放于荧光显微镜下观察染色结果。带有登革病毒蚊虫会发生 特异性黄纟ffe荧光，阴性蚊虫则无。采用本专利技术戶脱，可以省去病毒分 离培养这一步，直接从血液标本或媒介蛟体内检测出登革病毒抗原，无疑可做到早 期诊断或及早发现阳性^^某，从而控制登革热的播散。权利要求1、，其特征在于采用人工经口感染蚊虫DEN-2病毒，分别用细胞培养接种及蚊头部压片免疫荧光法进行了检测，确认埃及伊蚊、白纹伊蚊和C6/36细胞成功感染了病毒，用蚊头部压片免疫荧光技术，可直接检测出蚊体内是否携带病毒，取单只饱血感染的白纹伊蚊-20℃冻麻，在解剖镜下用手术刀将蚊头部切下，置于玻片上用解剖针挤压头部，使脑内物质流出、涂匀；晾干后用预冷丙酮固定10min；滴加用PBS稀释的小鼠抗DEN-2病毒IgG；放湿盒内；在37℃条件下孵育30min，PBGS洗涤3次，自然晾干后滴加用伊文氏蓝PBS稀释至工作浓度的羊抗鼠IgG-FITC、37℃孵育30min，PBS洗涤，于荧光显微镜下观察染色结果。全文摘要，采用人工经口感染蚊虫DEN-2病毒，分别用细胞培养接种及蚊头部压片免疫荧光法进行了检测，用蚊头部压片免疫荧光技术，检测出蚊体内是否携带病毒。本专利技术取单只饱血感染的白纹伊蚊-20℃冻麻，在解剖镜下用手术刀将蚊头部切下，置于玻片上用解剖针挤压头部，使脑内物质流出、涂匀；晾干后用预冷丙酮固定10min；滴加用PBS稀释的小鼠抗DEN-2病毒IgG；放湿盒内；在37℃条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
免疫荧光技术检测蚊虫体内登革病毒的方法，其特征在于采用人工经口感染蚊虫ＤＥＮ－２病毒，分别用细胞培养接种及蚊头部压片免疫荧光法进行了检测，确认埃及伊蚊、白纹伊蚊和Ｃ６／３６细胞成功感染了病毒，用蚊头部压片免疫荧光技术，可直接检测出蚊体内是否携带病毒，取单只饱血感染的白纹伊蚊－２０℃冻麻，在解剖镜下用手术刀将蚊头部切下，置于玻片上用解剖针挤压头部，使脑内物质流出、涂匀；晾干后用预冷丙酮固定１０ｍｉｎ；滴加用ＰＢＳ稀释的小鼠抗ＤＥＮ－２病毒ＩｇＧ；放湿盒内；在３７℃条件下孵育３０ｍｉｎ，ＰＢＧＳ洗涤３次，自然晾干后滴加用伊文氏蓝ＰＢＳ稀释至工作浓度的羊抗鼠ＩｇＧ－ＦＩＴＣ、３７℃孵育３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤，于荧光显微镜下观察染色结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵玉强，
申请(专利权)人：山东省寄生虫病防治研究所，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]