转Ｂｔ基因甘蔗对螟虫抗性的快速鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种转Ｂｔ基因甘蔗对螟虫抗性的人工接虫快速鉴定方法，包括温室桶栽甘蔗、虫源选择、人工接虫和抗性评价步骤，其中对同一批待评价的转Ｂｔ基因甘蔗品系的试验虫源为同一头甘蔗条螟雌蛾所产卵的初孵幼虫，或将２～３头雌蛾产生的初孵幼虫分别平均分配到每株待测蔗株，对桶栽试验甘蔗进行人工接虫５天后调查结果，根据幼虫的成活率、甘蔗的受害程度综合评价参试甘蔗品系的抗虫性。本发明专利技术的最显著的特点是：１．最大限度地保证试验虫源的一致性和接虫时间的统一性，确保鉴定结果的准确性；２．抗虫性鉴定周期短，７～１０天即可得到试验结果；３．不存在田间条件下天敌和特殊的天气（如暴风雨）的影响，试验结果可靠；４．本方法可操作性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及作物分子育种与抗性育种
，尤其是转Bt基因甘蔗抗虫性鉴 定方法。 技术背景甘蔗螟虫是我国蔗区广泛发生且为害最为严重的一类甘蔗害虫。因甘蔗螟虫为 害造成甘蔗损失一般达10% 25%，重者可达40% 60%，同时还导致甘蔗糖分 损失和诱发某些茎部病害。甘蔗螟虫是鳞翅目的一类钻蛀性害虫。我国蔗区常见的甘蔗螟虫有条螟、二点 螟、黄螟、大螟和白螟等，其中，条螟(/Vocemyvewo犯^附Walker)是为害最为严重的一种甘蔗螟虫。甘蔗条螟在全国各蔗区都有发生。条螟为害在甘蔗苗期造成枯心， 甘蔗拔节后造成螟害节、枯梢(死尾)、大量长侧芽，遇大风时形成风折茎，导致 甘蔗产量和糖分严重损失。由于甘蔗本身缺乏抗源，甘蔗抗螟育种未取得大的进展，生产上没有真正的抗 螟品种。虽有螟害相对较轻的品种，但多是纤维份较高而不利于螟虫取食的品种， 其工艺性状一般也较差。多数丰产高糖的甘蔗良种也是螟害较重的品种。长期以来， 甘蔗螟虫防治主要以农药防治为主。长期大量使用杀虫剂，既增加了生产成本，也 造成环境污染，破坏生态平衡。值得注意的是，螟虫的发生和为害并未因连年施用 大量杀虫剂而得到理想的控制。通过分子育种手段，导入外源抗虫基因，选育抗虫 甘蔗品种并因地制宜地推广应用，可望有效地控制甘蔗螟虫的种群增长，大幅度减 少农药施用量和施用次数，减轻虫害造成的损失。这无疑对增产增收、降低生产成 本和减少环境污染都有着重大的意义。苏云金芽孢杆菌(5a"7/u^/nW"g/e"^，简称Bt)能产生蛋白性质的伴孢晶体， 对多种昆虫、线虫、螨类等原生动物具有特异的杀虫活性对人畜无害，不污染环境， 因而被广泛应用于害虫的生物防治。其中Cryl系列的S—内毒素对鳞翅目 a印Wo/7fera)害虫特别有效，因而CryI中的许多基因已被广泛用于植物的抗虫基 因工程。将Bt基因导入栽培甘蔗，将可解决甘蔗自身抗虫基因源缺乏的问题，育成 抗虫品种。Arencibia A等人(Mol Breeding 1997， 3: 247-255 )将cryIAb基因构建于CaMV 35S启动子下游，转化甘蔗，CryIAb蛋白在转基因甘蔗中的表达量不高，无法高效 地抵抗甘蔗钻心虫。这可能是由于适用于双子叶植物的CaMV35S启动子在单子叶 植物中表达不佳(AdangMJ, Plant MolBiol 1993, 21:1131-1145)。 Dawen等人(Plant Science 2003, 165: 743-750)报道，在转基因甘蔗中PUbi启动子(玉米泛激素启动 子)可带动GUS基因表达，但测不到在CaMV35S启动子下GUS基因的表达。我 们在甘蔗的转基因瞬间表达试验中也发现，PUbi启动子比CaMV 35S启动子强5 6倍(Weng,Li-Xing等，Pest Management Science, 2005 In Press),获得一批高表达 的转Bt基因抗虫甘蔗品系。抗虫性评价是转基因抗虫育种的一道重要程序。转Bt基因甘蔗抗虫性可通过标 记基因检测、目的基因检测、毒蛋白检测和生物测定等方法来评价，但最终都要以 自然条件下生长甘蔗的抗虫表现为依据，即要经过田间条件或模拟田间条件的试验 来评价。田间抗虫性鉴定的试验周期长，受自然条件影响(如虫源的自然分布、天 敌干扰和风、雨影响等)大，很多不能人为控制的因素导致试验处理间条件的不一 致性和试验结果的可比性，往往需要多年多试验的结果去作综合评价，因此难于在 短时间内得到可靠的试验结果。人工接虫鉴定可有效地避免田间不可控因素的影 响，并可在较短时间内获得结果。但以往人工接虫鉴定是以田间采集虫卵，室内孵 化出幼虫为接种虫源。螟虫卵天敌自然寄生率高(达90%左右，甚至更高)，难于 得到足够的幼虫供试验之需，特别是待鉴定品系较多时。同时由于试验虫源来源不 一致和接虫时间难于统一而影响测定结果。甘蔗条螟是发生最普遍、为害最严重的螟虫，幼虫在心叶取食，入侵后第2天 就可见其取食留下的食痕(俗称"花叶")，食量大，中毒表现也快。本专利技术以甘蔗 条螟为代表螟虫种类，主要技术特征(l)用于试验的螟虫种类具有较好的代表性， 为害症状出现快、明显可见，并有特异性，容易观察和调查；(2)试验虫源来源和 接虫时间一致，接到每株待鉴定甘蔗上的幼虫的来源和数量具可比性，并将同一来 源的幼虫在同一时间段平均分配到各株待测甘蔗植株上；(3)适宜的试验甘蔗培育 方法和抗螟性评价方法，在接虫后7 10天可得到试验结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出一种，其可在室 内环境下进行，具有试验周期短，可排除田间天敌和特殊天气(如暴风雨)的影响， 试验结果可靠等优点。本专利技术的目的可通过如下途径来实现一种，其特征在于包括如下步骤A. 温室桶栽甘蔗；B. 虫源选择以初孵化的条螟幼虫为试验虫源；C. 人工接虫将步骤B的虫源人工接虫到步骤A的桶栽甘蔗上；D. 抗性评价经步骤C的人工接虫7天后调查结果，根据幼虫的成活率、 甘蔗的受害程度综合评价参试甘蔗品系的抗虫性。其中步骤B中，对同一批待评价转基因甘蔗品系的试验虫源，可以为同一头甘 蔗条螟雌蛾所产卵的初孵幼虫，也可以是将2 3头雌蛾产生的初孵幼虫分别平均分配到每株待测蔗株。步骤B中获得试验虫源的步骤如下Bl.在蔗田采集甘蔗条螟的蛹，置于盒内，在室内条件下羽化，让雌、雄蛾自 然交配；B2.选择成功交配后的雌蛾，放入透明的塑料瓶内，每瓶1头雌蛾，待其产卵 后4天内，用剪刀或小刀将卵块连同塑料瓶壁逐一取下，在体视镜下计算每块卵粒 数，并将卵块置于放有吸水纸的培养皿内保湿；根据同一雌蛾产的总卵粒数和待接虫的试验甘蔗的株数，计划每株甘蔗接虫的 数量；作为优化，步骤C中接虫时间的确定发现卵中有小黑点时，即做好接虫的准 备，有幼虫孵化时立即开始接虫。作为优化，步骤A中，在温室内桶栽培育待进行抗螟性鉴定的转Bt基因甘蔗品系及其受体品种，每桶下种4个蔗芽，成苗后每桶留苗2 4株；选择株高1 1.5米的甘蔗作 为试验的适宜株龄；步骤C中，将初孵的幼虫按计划接虫的数量接至每株试验甘蔗的心叶部，每株甘 蔗的心叶接上10头的初孵条螟幼虫，接虫持续时间为1 2天；步骤D中，接虫第2天后可观察心叶的受害状，5天后调查幼虫的生存情况和蔗株受害程度，按"抗虫蔗株条螟侵害程度分级标准"评定参试品系的抗性级别。 作为进一步优化，步骤C中，要求同一试验的每株甘蔗同一天接入相同数量的来自同一雌蛾的初孵幼虫。与现有技术相比，本专利技术具有如下突出的实质性特点和显著进步(1) 以甘蔗条螟(尸raceras wmw^"m Walker)为代表虫类，其在我国蔗区发生 最普遍、为害最严重，入侵取食后症状出现快而明显；(2) 以采条螟蛹在室内羽化，在控制条件下获得虫卵，以初孵化的条螟幼虫(一 龄幼虫)为试验虫源，解决了卵寄生天敌影响的问题，虫源获取方法的可操作性强。(3) 每个试验只用同一雌蛾产的卵的初孵幼虫为虫源，或将2 3头雌蛾产生的初孵幼虫分别平均分配到每株待测蔗株，最大限度地减少试验虫源个体之间的差异，确保抗虫性鉴定结果的准确性；(4) 试验周期短，在接虫后7 10天可得到试验结果。(5) 排除了田间天敌和特殊天气(如曝风雨)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转Ｂｔ基因甘蔗对螟虫抗性的快速鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：Ａ．温室桶栽甘蔗；Ｂ．虫源选择，以初孵化的条螟幼虫为试验虫源；Ｃ．人工接虫，将步骤Ｂ的虫源人工接虫到步骤Ａ的桶栽甘蔗上；Ｄ．抗性评价，经步骤Ｃ的人工接虫５天后调查结果，根据幼虫的成活率、甘蔗的受害程度综合评价参试甘蔗品系的抗虫性；其中步骤Ｂ中对同一批待评价的转Ｂｔ基因甘蔗品系的试验虫源为同一头条螟雌蛾所产卵的初孵幼虫。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓海华，翁丽星，黎教良，徐金玲，李奇伟，汪联辉，张琼，陈仲华，沈万宽，陈海宁，劳方业，杨湛端，
申请(专利权)人：广州甘蔗糖业研究所，翁丽星，徐金玲，汪联辉，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]