一种新的信号芋螺毒素序列、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种新的信号芋螺毒素序列、制备方法及其应用。从中国南海信号芋螺毒管中分离得到的核苷酸序列如序列表中＜４００＞１序列所示，以及含有上述基因编码的氨基酸序列、或其保守性变异多肽序列或其活性衍生物的多肽。该多肽的生产方法是：将成熟肽基因克隆到原核融合表达载体ｐＴＲＸ上，构建表达质粒并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）；培养并进行超声裂解，将表达产物的裂解液层析得到融合蛋白；后经３Ｃ蛋白酶切割、离子交换层析和反相高效液相层析，得到重组Ｌｔ１５．１多肽的成熟肽。本发明专利技术的目的在于提供一种具有新的半胱氨酸骨架的中国南海信号芋螺毒素基因Ｌｔ１５．１及其编码的多肽片段ｌｔ１５ａ，并为制备神经生物学研究的工具药和治疗多种疾病的药物提供数据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种中国南海信号芋螺毒素基因Ltl5.1及其编码的多肽序列 ltl5a和该多肽的制备技术，以及该毒素在神经生物学研究和离子通道药物开发 中的应用。技术背景芋螺属于软体动物门，腹足纲，芋螺科(Conidae)，多数栖息在热带海洋的 浅海水域，因外形呈圆锥形或芋头状而得名，表面常有各色花纹，壳口窄长。芋 螺是比较年轻的生物，化石记录证明芋螺属最早出现于始新世(Eocene)，中生 代(mesozoic)时期海洋捕食性软体动物菊石的消失客观上促进了芋螺的第一次 大规模的物种形成。芋螺的第二次大规模的辐射始于中新世(Miocene)，基本上 持续到现在(Teriau and Olivera， 2004)。芋螺具有强大的自然进化能力，全球有约700种芋螺，芋螺是海洋无脊椎动 物中进化最成功的生物之一。芋螺虽然种类很多，但他们都是食肉动物，靠毒液 来捕食，根据其捕食习性可分为食鱼芋螺(piscivorous)、食螺芋螺 (molluscivorous)、食虫芋螺(vermivorous)。食虫性芋螺种类最多，占全部芋 螺种类的70%左右。三种芋螺中食鱼芋螺毒液的毒性最高，食虫芋螺的毒性最低。芋螺毒液是芋螺捕食与防御的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒 样的混合毒素，称为芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素通常为由7 41个氨基酸 残基组成的小分子多肽。大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。与蜘 蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒素比较(40 80个氨基酸左右)，芋螺毒素的 肽链短得多，富含二硫键，分子结构更为紧密，生物活性更高。大多数芋螺毒素 均由单一的mRNA编码，原始的翻译产物是一种特定的多肽前体，约为70-100个 氨基酸残基，经蛋白酶水解后得到成熟肽。这些成熟肽分别选择性的作用于钙、 钠、钾离子通道，或者乙酰胆碱、NMDA、 5-羟色胺等受体，许多已经成为神经生 理学研究的工具药。但是，目前已知的芋螺毒素大多是从食鱼芋螺中分离得到， 食虫芋螺的毒液研究的相对较少。二十世纪八十年代初，美国犹它大学01ivera BM学者实验室最早开展了芋 螺毒素全面系统研究工作。芋螺毒素按照其结构特点(前体肽中N端高度保守的 信号肽区和C端的二硫键骨架)，可分为不同的超家族。至今己经得到分离的芋 螺毒素有近千种，数十种芋螺毒素己申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保 护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临 床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前， 由Elan公司进行开发的co-CTXMWA (SNXm，商品名Ziconotide)，因其直 接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已 成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了ni期临床试验，正式被FDA 批准上市。而另一个衍生于(o-CTX C VID的化合物AM336作用类似于 Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严 重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为 NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癲痫有效，也已完成I期临床 试验。另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成 为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、 受体鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。芋螺在我国南海海域有广泛分布，已查明的芋螺约有80余种，主要分布在 台湾、广东、广西、海南诸省以及西沙和南沙群岛等。近年来国内也开展了芋螺 毒素的生物化学、分子生物学以及药理作用等方面的研究工作。陈冀胜等人自桶 形芋螺(C. 6em/i'mw)、独特芋螺(C. cflra"eW幼7ews)、菖蒲芋螺(C. ve;cz7/wm)、 地纹芋螺等类芋螺中分离鉴定了十余种新序列的芋螺毒素。卢柏松、黄培堂以及 戴秋云等从我国的线纹芋螺、织锦芋螺中也发现了一些新的毒素成分和基因序 列。热带农业大学彭世清、罗素兰等己从菖蒲芋螺基因组中克隆到两个新芋螺毒 素基因；同时还从海南产的大理石芋螺(C. wflnwow^)、幻芋螺(C./wagw)、 等共12个种中分别发现了具有药用功能的35种O-超家族芋螺毒素及其基因。 虽然我国有着丰富的芋螺资源，但目前对于芋螺毒素的研究尚处于初期阶段，有 着广阔的研究空间和开发前景。由于芋螺毒素在其基因序列和蛋白质结构及功能方面差异较大，具有种类繁多，结构复杂和高度遗传多样性特征。构建信号芋螺毒管cDNA文库可以系统地 研究食虫芋螺的毒素组成、表达谱，发现新的食虫芋螺特有的毒素序列。迄今为 止，国外己构建了多种芋螺的cDNA文库，中国南海信号芋螺是一种食虫性芋 螺，世界上尚没有关于它的毒素研究的报道。另外，目前有关芋螺毒素的生化结构及其神经药理活性的研究都是基于天然 提取毒素的分子结构，用人工合成的毒素来研究的。虽然已克隆到很多芋螺毒素 基因，但目前鲜有芋螺毒素基因体外表达的报道。重组芋螺毒素将以其质优、价 廉的优势，代替产率低、成本昂贵的人工合成毒素。开展芋螺毒素体外表达技术 的研究，将具有非常重要的理论研究价值和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有新的半胱氨酸骨架的中国南海信号芋螺毒 素基因Ltl5.1及其编码的多肽片段ltl5a。本专利技术的另一目的在于提供该多肽的生产方法。本专利技术的第三个目的在于提供了用全细胞膜片钳技术考察了该多肽对大鼠 DRG细胞钠电流的抑制作用，从而为制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失 常、顽痛、癫痫以及中风等疾病药物提供数据。通过cDNA文库的构建和测序的方法，从中国南海信号芋螺毒管中分离得 到具有新的半胱氨酸骨架的芋螺毒素Ltl5.1基因，其DNA序列如序列表中〈4001序列所示。上述本专利技术基因所编码的多肽M5a，其氨基酸序列如序列表中<400> 2序列 所示；其成熟肽的分子量为4，266.8道尔顿，其理论等电点为6.79。该蛋白通过原核细胞融合表达载体pTRX在大肠杆菌中以胞内可溶的形式 表达。所述表达载体pTRX (我实验室自行构建并申请专利，为 一种高 效原核表达载体，专利申请号ZL00 1 24832.4)是以硫氧还蛋白为融合伴体， 中间插入His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体。该重组信号芋螺毒素ltl5a能增加钠通道电流的开放时间，同时降低钠电流 峰值。本专利技术所选择的信号芋螺采自海南省三亚市。信号芋螺毒管cDNA文库的构建取活螺体，使用喉闸破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，提取总RNA。反转录为一链cDNA后合 成双链cDNA，双链cDNA与pMD18T载体连接后转化五co//,并保存每个重组 克隆。本专利技术通过对文库重组克隆大规模序列测定，从中得到了 1个新的编码芋螺毒素的克隆，命名为Ltl5.1 (其DNA序列如序列表中〈40Ol序列所示)。新基因编码86个氨基酸残基，包括有23个氨基酸的信号肽、26个氨基酸的前导肽和37个氨基酸的成熟肽。其信号肽序列和成熟肽的半胱氨酸排布与O-超家族芋螺毒素其它成员本文档来自技高网...

【技术保护点】
从中国南海信号芋螺毒管中分离得到的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表中〈４００〉１序列所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐安龙，孙丹丹，王磊，蒋秀华，任政华，刘君梁，曾夏芸，周茂军，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[]