本发明专利技术提供基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法，是运用一套筛选和评价硬件系统，通过不同荧光染料标记和测量细胞内多细胞参数变化实现对抗肿瘤药物评价和筛选。该筛选和评价硬件系统由高精度电动水云平台，荧光视觉系统，图像采集与处理系统，工作站组成。通过二乙酸荧光素染色测量活细胞数法；Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２和碘化丙啶双染法评价药物诱导细胞凋亡；ＦＤＡ、Ｈｏ－ｅｃｈｓｔ３３３４２和ＰＩ三染法分析药物诱导凋亡作用模式。本发明专利技术可对表达不同靶标细胞器的至少两种单细胞或两种细胞亚群进行测量，方法设计合理，既能用于药物作用机理的研究，也能用于高内涵药物筛选和毒性分析，可在筛选药物和评价药物毒性中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属药物筛选方法领域，涉及应用细胞显微图像信息的自动化技术和 光学标记、光学测量技术来记录多孔板内的细胞图像，通过分析图像信息来获 取抗肿瘤化合物筛选评价的指标。
技术介绍
癌症严重地威胁着人们的健康，其中肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病是几种 发病率较高的癌症。肺癌已成为我国第一大癌症，且发病率及死亡率增长最为 迅速。肝癌发病率则仅次于肺癌，某些地区肝癌发病率呈逐年增高的趋势，全世界每年死于肝癌的患者约26万人，我国近10万人。统计资料显示，几乎所 有人群的乳腺癌发病率都在上升，平均每年约升高1%，估计全球每年发病患 者超过100万人。尽管对乳腺癌的治疗已经取得了很大的进步，但仍然有25 %的患者死于该病。而白血病则是20岁以下青年死亡的主要病因之一。白血 病的化学治疗一直是医学和药学研究的重点领域，早期开发的白血病化疗药物 特异性不强，既能有效的杀灭肿瘤细胞，又对正常人体细胞有杀伤作用，毒副 反应较大，病人很难坚持长期用药。肿瘤细胞对于药物或化合物的敏感性通常通过细胞毒试验得到。细胞毒试 验有很多方法，较为常见的是通过染色手段将细胞的活性信息转化为光学信 号，经检测光学信号推导出活细胞的数量，从而判断用药物产生的细胞毒性。 目前，MTT、 SRB法是最普遍、最常用的细胞毒实验方法，已有很多研究者采 用该方法进行药物筛选，但是，这些方法存在速度慢、灵敏度差、自动化程度 低等缺陷，难以满足高通量药物筛选的需要。其它用于细胞毒性检测的方法包 括HPLC检测法、同位素标记检测法和流式细胞仪法等，这些方法存在分别存 在手段繁琐、具有放射性污染和适用细胞类型有限等不足之处。因此，寻找快 速、准确、稳定的药物筛选方法成为目前肿瘤化疗领域中亟待解决的关键技术 问题。高内涵筛选(high content screening, HCS)是通过显微成像和扫描的方法 来记录孔板内的细胞图像，并分析图像中的空间分辨信息的技术。高内涵筛选 通过分析和统计图像中各个细胞的形态、结构等参数来表征细胞的生理或病理 特征，其优点在于它能够很快区分出具有所需生物学效应的化合物和非特异性 作用的化合物。例如，凋亡的过程伴随着很多胞内的代谢途径的变化，也包含 众多药物作用的靶标，高内涵筛选应用于药物诱导细胞凋亡过程的研究，可观 察和区分细胞凋亡过程中的形态学变化标志，如细胞縮小、染色质浓縮、核膜 和核的破裂、凋亡小体形成等。HCS系统可以快速、准确地对各种规格的孔板 内经由荧光标记细胞的活性进行定量分析，动态监控细胞在药物作用下的活性 改变，因此本专利技术中的多维方法可通过测量化合物对多细胞参数的影响来筛选 抗肿瘤化合物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方 法，是运用一套筛选和评价硬件系统，通过不同荧光染料标记和测量细胞内多 细胞参数变化实现对抗肿瘤药物评价和筛选。该筛选和评价硬件系统由高精度 电动水云平台，荧光视觉系统，图像采集与处理系统，工作站组成，具体通过 以下步骤实现(1) 二乙酸荧光素(fluorescein diacetate, FDA)染色测量活细胞数法 FDA本身没有荧光，它能通过完整细胞膜，在细胞内被酯酶酶切而产生荧光物质。该荧光物质不能通过细胞膜，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。因此活细胞量等于发射绿色荧光的细胞数量。 准确称取FDAlmg溶于0.1ml二甲亚砜(DMSO)中配成FDA储备液，分装于0.5 ml离心管中，置于-20'C储存。临用前，用PBS稀释FDA储备液1000倍待用。A) FDA染色测量活细胞数法线性范围取对数生长期的人口腔鳞状细胞(KB)细胞，用乙二胺四乙酸(EDTA) -胰酶混合溶液消化后，以5xl04、 lxl04、 5xl03、 lx103、 2xl02、 4xl01细胞/ 孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100 培养液，每个细胞密度设6个 复孔，在37。C、 100%湿度、含5%(:02和95%空气的条件下培养24h。测试 前弃去孔内培养液，每孔加入FDA的磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液50 nL， 4'C 培养30min后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，拍摄参数为绿色通道(激发光450-490 nm、发射光"10nm)，物镜放大倍数5倍，每孔摄取1 幅图像，然后使用筛选和评价系统的工作站分析所得图像，计算孔内细胞数。 B) FDA染色测量活细胞数法实验质量控制取对数生长期的KB细胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化后，以3"03细胞/ 孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100 培养液，在37'C、 100%湿度、 含5% (:02和95%空气的条件下培养24h。用lxl(T7M长春新碱(VCR)作 为阳性对照，0.1。/。DMSO作为阴性对照，设4个平行孔，每孔加入200pL培 养液。孵育48h后，弃去培养液，每孔加入FDA的PBS溶液50pL， 4。C培养 30 min后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后后使用工作站分析所 得图像，计算孔内细胞数和Z'因子。(2) Hoechst 33342和碘化丙啶(propidium iodide， PI)双染法评价药物 诱导细胞凋亡细胞发生凋亡时，染色质会固縮。Hoechst 33342可以穿透细胞膜，染色后 凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。PI则不能穿透细胞膜，对于具有完整细 胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧 失，PI可以染色坏死细胞。上述两种染料双染后，使用荧光显微镜检测时，正 常细胞为弱红色荧光+弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光+强蓝色荧光，坏死 细胞为强红色荧光+强蓝色荧光。取对数生长期的KB细胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化后，以2><103细胞/ 孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100 jaL培养液，在37。C、 100%湿度、 含5%0)2和95%空气的条件下培养24h后，弃去培养液。分别将不同浓度的 长春新碱(2xl(T7、 2xl(T6 M)加入孔内，每一药物浓度设4个平行孔，每孔 加入200 pL培养液。孵育48h后，弃去培养液，每孔加入细胞凋亡与坏死检 测试剂50pL， 4。C培养30min后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像， 然后使用工作站分析所得图像，并统计每个细胞的蓝色、红色荧光强度。(3) FDA、 Hoechst 33342和PI三染法分析药物诱导凋亡作用模式 虽然Hoechst 33342、 PI双染法可以区分药物作用后细胞凋亡发生的情况，但是由于Hoechst 33342、 PI两种都是核染料，因此在蓝红两个通道下都无法 得到细胞的形态学信息，然而区别细胞凋亡最重要的标志是细胞形态学特征的 变化，如细胞縮小、染色质浓縮、核膜和核的破裂、凋亡小体形成等。为了获 得更多细胞形态学特征，还需要另一种荧光染料对整个细胞进行标记。FDA的 酯酶酶切产物能在活细胞内聚集，因此整个细胞可见绿色荧光。根据表1可知 FDA的激发和发射波长与PI和Hoechst都没有重叠，因此能够通过不同的滤 光片对三种荧光加以区分。表1 Hoechst 33342、 FDA、 PI荧光激发和发射波本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法，其特征是包括由高精度电动水云平台，荧光视觉系统，图像采集与处理系统，工作站组成的筛选和评价硬件系统，通过不同荧光染料标记和测量细胞内多细胞参数变化实现，具体通过以下步骤实现：（１）二乙酸荧光素染色测量活细胞数法准确称取二乙酸荧光素１ｍｇ溶于０．１ｍｌ二甲亚砜（ＤＭＳＯ）中配成储备液，分装于０．５ｍｌ离心管中，置于－２０℃储存，临用前，用ＰＢＳ稀释储备液１０００倍待用，Ａ）二乙酸荧光素染色测量活细胞数法线性范围取对数生长期的ＫＢ细胞，用乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）－胰酶混合溶液消化后，接种于９６孔培养板上，每孔含１００μＬ培养液，每个细胞密度设６个复孔，培养２４小时，测试前弃去孔内培养液，每孔加入二乙酸荧光素的ＰＢＳ溶液５０μＬ，４℃培养３０分钟后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后使用筛选和评价系统的工作站分析所得图像，计算孔内细胞数，Ｂ）二乙酸荧光素染色测量活细胞数法实验质量控制取对数生长期的ＫＢ细胞，用ＥＤＴＡ－胰酶混合溶液消化后，接种于９６孔培养板上，每孔含１００μＬ培养液，培养２４小时，用１×１０↑［－７］Ｍ长春新碱作为阳性对照，０．１％二甲亚砜作为阴性对照，设４个平行孔，每孔加入２００μＬ培养液，孵育，弃去培养液，每孔加入二乙酸荧光素的ＰＢＳ溶液，培养３０分钟后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后后使用工作站分析所得图像，计算孔内细胞数和Ｚ′因子；（２）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２和碘化丙啶双染法评价药物诱导细胞凋亡取对数生长期的ＫＢ细胞，用ＥＤＴＡ－胰酶混合溶液消化后，接种于９６孔培养板上，每孔含１００μＬ培养液，培养２４小时后，弃去培养液，分别将２×１０↑［－７］、２×１０↑［－６］Ｍ不同浓度的长春新碱加入孔内，每一药物浓度设４个平行孔，每孔加入２００μＬ培养液，孵育４８小时后，弃去培养液，每孔加入细胞凋亡与坏死检测试剂５０μＬ，培养３０分钟后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后使用工作站分析所得图像，并统计每个细胞的蓝色、红色荧光强度；（３）二乙酸荧光素、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２和碘化丙啶三染法分析药物诱导凋亡作用模式取对数生长期的ＫＢ细胞，用ＥＤＴＡ－胰酶混合溶液消化后，接种于９６孔培养板上，每孔含１００μＬ培养液，培养２４小时后，弃去培养液，分别将各种中药组分和作为阳性对照的长春新碱加入孔内，每一药物浓度设３个平行孔，每孔加入２０...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程翼宇，周晨光，黄欣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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