一种怀玉山高山马铃薯包埋玻璃化法超低温脱毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种怀玉山高山马铃薯包埋玻璃化法超低温脱毒的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术首先将怀玉山高山马铃薯茎尖包埋制成包埋珠，然后对得到的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠进行两次预培养和两次装载处理，脱水后，经液氮超低温保存处理后化冻，然后将得到的茎尖先进行暗培养再进行光照培养，得到怀玉山高山马铃薯的脱毒植株。本发明专利技术培育得到的怀玉山高山马铃薯脱毒植株生长状态良好，成活率高，脱毒率显著提高，同时本发明专利技术还具有制备方法简单易行、培养周期短的特点，能够实现批量生产。

【技术实现步骤摘要】
一种怀玉山高山马铃薯包埋玻璃化法超低温脱毒的方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种怀玉山高山马铃薯茎尖脱毒的方法。
技术介绍
怀玉山高山马铃薯产于江西省玉山县西北60公里处怀玉乡境内，是国家地理标志农产品，但在怀玉山高山马铃薯的种植过程中易感染病毒而引起退化，直接影响了品质及产量,严重阻碍了怀玉山高山马铃薯的生产和利用。马铃薯脱毒技术,是解决马铃薯种薯退化的主要技术措施。因此，脱毒种薯越来越受到广大马铃薯栽培者的欢迎。我国在马铃薯茎尖组织培养方面也取得了很多研究成果,并在各地建成脱毒种薯繁育体系。马铃薯茎尖组织培养脱毒苗是马铃薯脱毒种薯产业的基础,优质快速的茎尖培养为以后脱毒苗和脱毒薯的生产赢得了时间和效益。通过组织培养途径，从而建立无病毒生产体系是目前非常有效的获得无病毒植株的途径。利用常规茎尖培养以及热处理+茎尖培养是目前解决马铃薯种薯退化最常用最传统的两种方法，但其存在费时、褐化、植株再生偏难、脱毒效果较差等局限(高慧卿等,2010,山西农业大学学报，30(6)528-532)。超低温疗法(Cryotherapy)是近年发展起来的一种新型脱毒技术，该方法茎尖切取简单、操作方便、实验周期短，马铃薯茎尖组织的成苗率和脱毒率得到了提升，已成功用于几种植物病毒的脱除,为植物病毒的脱除开辟了新的途径，其中以包埋玻璃化法超低温疗法的培养效果最好。然而，目前包埋玻璃化法超低温疗法用于脱毒马铃薯茎尖培养依然存在效率较低,成苗率和脱毒率还有待提高的技术问题，因此，对马铃薯茎尖包埋玻璃化法超低温疗法进行改善非常必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种怀玉山高山马铃薯包埋玻璃化法超低温脱毒的方法，以解决上述现有技术存在的问题，使马铃薯茎尖组织培养效率高且培养得到的脱毒苗的脱毒率高、成苗率高。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种怀玉山高山马铃薯包埋玻璃化法超低温脱毒的方法，包括以下步骤：1.一种怀玉山高山马铃薯包埋玻璃化法超低温脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)无菌条件下，将怀玉山高山马铃薯茎尖与含海藻酸钠和蔗糖的无钙离子改良MS培养液混合均匀，得混合液；(2)包埋：无菌条件下，将步骤(1)的混合液滴入含有壳寡糖、石墨烯量子点、碳纳米管、CaCl2和蔗糖的MS培养液中进行包埋，得到怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠；(3)一次预培养：无菌条件下，将怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠用含壳寡糖和石墨烯量子点的MS培养液进行一次预培养；(4)二次预培养：无菌条件下，将经过一次预培养处理的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠用含壳寡糖和碳纳米管的MS培养液进行二次预培养；(5)一次装载：无菌条件下，将经过两次预培养的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠用含壳寡糖和石墨烯量子点的MS培养液进行装载；(6)二次装载：无菌条件下，将步骤(5)得到的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠用含壳寡糖和碳纳米管的MS培养液进行二次装载；(7)脱水处理：无菌条件下，将步骤(6)得到的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠用含25％甘油+20％乙二醇+15％壳寡糖+0.4M石墨烯量子点+0.4M碳纳米管的MS培养液进行脱水处理；(8)无菌条件下，将步骤(7)经过脱水处理的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠置于液氮中保存，然后进行化冻，将茎尖从化冻后的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠中取出，含1.2M蔗糖的MS+0.05g/L壳寡糖+0.03-0.05g/L石墨烯量子点+0.03-0.05g/L碳纳米管的MS液体培养基中洗涤，洗涤后的茎尖先进行暗培养，然后在光照培养条件下培养，即得怀玉山高山马铃薯的脱毒植株。优选的，所述步骤(1)中海藻酸钠与无钙离子改良MS培养液的质量体积比为3％，蔗糖浓度为0.2mol/L；所述马铃薯茎尖长度为0.5-1cm。优选的，所述步骤(2)中壳寡糖浓度为0.05g/L，石墨烯量子点浓度为0.03-0.05g/L、碳纳米管浓度为0.03-0.05g/L、CaCl2浓度为0.1mol/L、蔗糖浓度为0.2mol/L。优选的，所述步骤(2)中包埋时间为38-42min,所述怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠的粒径为1.8-2cm。优选的，所述步骤(3)中壳寡糖浓度为0.05g/L，石墨烯量子点浓度为0.3-0.5g/L，预培养时间为24h；优选的，步骤(4)中壳寡糖浓度为0.05g/L，碳纳米管浓度为0.3-0.5g/L，预培养时间为24h。优选的，步骤(5)中，壳寡糖浓度为2M，石墨烯量子点浓度为0.4M，装载时间为1h；步骤(6)中，壳寡糖浓度为2M，碳纳米管浓度为0.4M，装载时间为1h；步骤(7)中脱水时间为1h。优选的，步骤(8)中化冻温度为37±1℃，暗培养的温度为25±2℃。优选的，步骤(8)中所述光照培养条件为光照时间14h/d，光强1500-2000lx，培养温度25±2℃。优选的，所述石墨烯量子的的厚度为1-2nm，粒径为6-7nm。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术首先将怀玉山高山马铃薯茎尖悬浮于的MS液体培养基上，然后将茎尖制成包埋珠，然后利用含有壳寡糖和石墨烯量子点以及含有壳寡糖和碳纳米管的MS培养基对得到的茎尖包埋珠进行两次预培养和两次装载处理，其中石墨烯量子点和碳纳米管丰富的结构能够增加脱水效果并吸附营养,且经过两次预培养和两次装载处理后保证了怀玉山高山马铃薯茎尖最终能够实现高的成苗率和脱毒率。本专利技术将处理后的茎尖先进行暗培养再进行光照培养，并控制光照条件和时间，从而可以修复超低温保存伤害，提高茎尖冻后存活率。本专利技术培养得到的怀玉山高山马铃薯的脱毒植株生长状态良好、成活率高、脱毒率高，且制备方法简单易行、培养周期短，能够用于批量生产。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种怀玉山高山马铃薯包埋玻璃化法超低温脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)无菌条件下，将怀玉山高山马铃薯茎尖与含海藻酸钠和蔗糖的无钙离子改良MS培养液混合均匀，得混合液；/n(2)包埋：无菌条件下，将步骤(1)的混合液滴入含有壳寡糖、石墨烯量子点、碳纳米管、CaCl

【技术特征摘要】
1.一种怀玉山高山马铃薯包埋玻璃化法超低温脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)无菌条件下，将怀玉山高山马铃薯茎尖与含海藻酸钠和蔗糖的无钙离子改良MS培养液混合均匀，得混合液；
(2)包埋：无菌条件下，将步骤(1)的混合液滴入含有壳寡糖、石墨烯量子点、碳纳米管、CaCl2和蔗糖的MS培养液中进行包埋，得到怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠；
(3)一次预培养：无菌条件下，将怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠用含壳寡糖和石墨烯量子点的MS培养液进行一次预培养；
(4)二次预培养：无菌条件下，将经过一次预培养处理的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠用含壳寡糖和碳纳米管的MS培养液进行二次预培养；
(5)一次装载：无菌条件下，将经过两次预培养的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠用含壳寡糖和石墨烯量子点的MS培养液进行装载；
(6)二次装载：无菌条件下，将步骤(5)得到的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠用含壳寡糖和碳纳米管的MS培养液进行二次装载；
(7)脱水处理：无菌条件下，将步骤(6)得到的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠用含25％甘油+20％乙二醇+15％壳寡糖+0.4M石墨烯量子点+0.4M碳纳米管的MS培养液进行脱水处理；
(8)无菌条件下，将步骤(7)经过脱水处理的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠置于液氮中保存，然后进行化冻，将茎尖从化冻后的怀玉山高山马铃薯茎尖包埋珠中取出，在含1.2M蔗糖的MS+0.05g/L壳寡糖+0.03-0.05g/L石墨烯量子点+0.03-0.05g/L碳纳米管的MS液体培养基中洗涤，洗涤后的茎尖先进行暗培养，然后在光照培养条件下培养，即得怀玉山高山马铃薯的脱毒植株。


2.根据权利要求1所述的一种怀玉山高山马铃薯包埋玻璃化法超低温脱毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中海藻酸钠与无钙离子改良MS培养液的质量体积比为3％，蔗糖浓度为0.2mol/L；所述马铃薯茎尖长度为0.5-1cm。


3.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪森荣，朱丽倩，尹明华，
申请(专利权)人：上饶师范学院，
类型：发明
国别省市：江西;36